PCR ve Gerçek Zamanlı PCR
PCR veya Polimeraz zincir reaksiyonu, ilk olarak 1983 yılında kimyager Kary Mullis tarafından geliştirilen, modern moleküler biyolojide devrim yaratan bir keşiftir. Kompleks bir DNA'daki tek bir dizinin analiz için amplifiye edilmesini sağlar. PCR'nin temel fikri, bir DNA dizisinin karşıt zincirlerini tamamlayıcı olan iki primerin birbirine doğru yönlendirilmiş olmasıdır; primerler, her biri diğer primeri içeren tamamlayıcı iplikler üretir. Bu nedenle, sonuç, iki primer arasında uzanan DNA'ya karşılık gelen büyük miktarda bir dizidir. PCR'de primerleri uzatmak için DNA polimeraz enzimi kullanılır. DNA polimeraz, termostabil bir enzimdir ve şablon DNA'nın denatürasyonu için kullanılan yüksek sıcaklıklarda (94 ila 95 °C) hayatta kalma kabiliyetine sahiptir.
PCR, tekrarlanan denatürasyon turları, primerlerin tavlanması ve DNA sentezi olmak üzere üç adımdan oluşur. Bu reaksiyonu gerçekleştirmek için bir termocycler makinesi kullanılır, böylece sıcaklıkları hızlı ve doğru bir şekilde değiştirecek şekilde programlanabilir. PCR'nin uygulamaları, cezai soruşturmalar, DNA parmak izi, patojenlerin tespiti ve erken insan türlerinin DNA'sının analizidir.
Konvansiyonel PCR nedir?
Geleneksel PCR'nin üç ana aşaması vardır, yani; DNA amplifikasyon aşaması, PCR'nin ayrılması ve ürünlerin tespiti. DNA segmentlerinin ayrılması tipik olarak agaroz jel elektroforezi ile yapılır. Ürünler daha sonra eteiduim bromür ile lekelenir. Son olarak, UV ışığı altında bantların jeller üzerinde görselleştirilmesiyle algılama sağlanır. Bu nedenle, geleneksel PCR'nin nihai sonuçları sayı olarak ifade edilmez. Normalde geleneksel PCR yalnızca tek bir parametreyi algılayabilir.
Gerçek Zamanlı PCR nedir?
Gerçek zamanlı PCR, ürünler sentezlendiğinden ürünlerin amplifikasyonunu algılayabilir. Teknolojinin gelişmesiyle birlikte özellikle gıdalardaki bakterilerin tespiti ve tanımlanmasında PCR oldukça popüler bir teknik haline gelmiştir. Gerçek zamanlı PCR, bir floresan boya sistemi ve floresan algılama özelliği ile donatılmış termocycler kullanır.
Geleneksel PCR ile Gerçek Zamanlı PCR arasındaki fark nedir?
• Geleneksel PCR, amplifiye PCR ürünlerini analiz etmek için jel elektroforezi kullandığından daha fazla zaman alır. Buna karşılık, gerçek zamanlı PCR, reaksiyonun erken aşamalarında amplifikasyonları tespit edebildiği için daha az zaman alır.
• Gerçek zamanlı PCR, PCR'nin üstel büyüme aşamasında veri toplarken, geleneksel PCR, reaksiyonun Bitiş Noktasında veri toplar.
• Geleneksel PCR'nin bitiş noktası sonuçları çok kesin olmayabilir, ancak gerçek zamanlı PCR'nin sonuçları çok kesindir.
• Gerçek zamanlı PCR, geleneksel PCR'den daha hassastır.
• Konvansiyonel PCR çok düşük çözünürlüğe sahipken, gerçek zamanlı PCR yüksek çözünürlük nedeniyle çok küçük değişiklikleri algılayabilir.
• Geleneksel PCR'nin son nokta tespiti kısa dinamik aralığa sahipken, gerçek zamanlı PCR tespiti geniş dinamik aralığa sahiptir.
• Geleneksel PCR'den farklı olarak, gerçek zamanlı PCR'de otomatik algılama teknikleri bulunur.
• Geleneksel PCR, gerçek zamanlı PCR'den çok daha karmaşık ve emek yoğundur.
• Gerçek zamanlı PCR'den farklı olarak, geleneksel PCR ölü ve canlı bakteriler arasında ayrım yapamaz.
• Gerçek zamanlı PCR, ürünleri algılamak için floresan boya sistemini kullanırken geleneksel PCR, agaroz jel ortamında bantları görselleştirmek için etidyum bromür ve UV ışığı kullanır.
