Geleneksel yuvalanmış ve gerçek zamanlı PCR testleri arasındaki temel fark, geleneksel PCR'nin belirli DNA dizilerini çoğ altmak için geliştirilmiş bir teknik olması ve yuvalanmış PCR'nin iki sıralı amplifikasyon reaksiyonundan oluşan geleneksel PCR'nin bir modifikasyonu olmasıdır. -time PCR, amplifiye ürünü ölçebilen bir geleneksel PCR çeşididir.
PCR, DNA'yı saptamak için araştırma ve tıpta yaygın olarak kullanılan çok yaygın bir bilimsel tekniktir. PCR testleri, DNA veya RNA'larını tespit ederek antijenleri tespit etmek için kullanılır. Genellikle viral RNA, antikorları tespit etmeden veya hastalığın semptomlarını göstermeden önce vücutta bulunur. Bir PCR testi, birinin virüse erken sahip olup olmadığını söyleyebilir. Şu anda PCR, COVID-19 hastalığını tespit etmek için standart testtir. Gerçek zamanlı PCR, iç içe PCR, multipleks PCR, sıcak başlangıç PCR ve uzun menzilli PCR vb. gibi farklı PCR teknikleri vardır.
Konvansiyonel PCR Testleri nelerdir?
Konvansiyonel PCR testi, moleküler biyolojik laboratuvarlarda rutin olarak gerçekleştirilen bir in vitro DNA amplifikasyon tekniğidir. Bu yöntem, belirli bir DNA parçasının binlerce ila milyonlarca kopyasının üretilmesini sağladı. Kary Mullis bu tekniği 1980'de tanıttı. Bu teknik, birçok kopyasının yapılabilmesi için şablon olarak bilinen bir DNA parçasına ihtiyaç duyuyor. Taq polimeraz, DNA polimeraz enzimi olarak çalışır ve şablon dizisinin yeni ipliklerinin sentezini katalize eder.
PCR karışımındaki primerler, parça uzantıları için başlangıç noktaları olarak çalışacaktır. DNA'nın kopyalarını yapmak için gerekli olan tüm bileşenler PCR karışımına dahildir. PCR reaksiyonu bir PCR makinesinde gerçekleştirilir ve doğru PCR karışımı ve doğru PCR programı ile beslenmelidir. Reaksiyon karışımı ve program doğruysa, çok az miktarda DNA'dan belirli bir DNA bölümünün gerekli sayıda kopyasını üretecektir.
Şekil 01: Konvansiyonel PCR Testi
Bir PCR reaksiyonunda yer alan üç ana adım vardır: denatürasyon, primer tavlama ve iplik uzatma. Bu üç adım, üç farklı sıcaklıkta gerçekleşir. PCR tamponu, Taq polimeraz eylemi için en uygun koşulları korur. PCR reaksiyonunun bu üç aşaması, gerekli miktarda PCR ürünü üretmek için tekrarlanır. Her PCR reaksiyonunda DNA kopyalarının sayısı ikiye katlanır. Bu nedenle, PCR'de üstel amplifikasyon gözlemlenebilir. PCR ürünü, jel üzerinde görünür miktarda DNA ürettiği için jel elektroforezi kullanılarak çözülebilir ve dizileme gibi daha ileri çalışmalar için saflaştırılabilir.
PCR, tıbbi ve biyolojik araştırmalarda değerli bir araçtır. Özellikle adli araştırmalarda PCR, suçluların küçük örneklerinden çalışmalar için DNA'yı çoğ altabilmesi ve adli DNA profilleri oluşturabilmesi nedeniyle çok büyük bir değere sahiptir. PCR, genotipleme, gen klonlama, mutasyon tespiti, DNA dizileme, DNA mikrodizileri ve babalık testi dahil olmak üzere moleküler biyolojinin birçok alanında yaygın olarak kullanılmaktadır.
Nested PCR Assays nedir?
Nested PCR, DNA'nın spesifik olmayan amplifikasyonunu az altan bir PCR türüdür. Yuvalanmış PCR testinde iki ardışık PCR veya iki ardışık amplifikasyon reaksiyonu vardır. İlk amplifikasyon reaksiyonu sırasında bir PCR ürünü üretilir. Birinci reaksiyondan sonra, birinci reaksiyonun PCR ürünü üzerinde ikinci bir amplifikasyon reaksiyonu gerçekleştirilir. Bu nedenle, ikinci reaksiyon karışımındaki primerler, birinci PCR ürününe bağlanır ve onu çoğ altır.
Şekil 02: Yuvalanmış PCR
Astar çiftleri her reaksiyonda farklıdır. Primerlerin spesifik olmayan bağlanması, yuvalanmış PCR'de azalır. Nested PCR testleri, duyarlılığı ve/veya özgüllüğü artırmak için yararlıdır. Ancak, yuvalanmış PCR, ilgili dizi hakkında bilgi gerektirir.
Gerçek Zamanlı PCR Testleri nelerdir?
Real-time PCR veya kantitatif PCR (Q PCR), PCR ürünlerini kantitatif olarak ölçen değiştirilmiş bir PCR sürümüdür. Bu nedenle, bu teknik, gerçek zamanlı bir PCR makinesi kullanarak gerçek zamanlı olarak amplifikasyonu nicelleştirir. Aynı zamanda, bir numunede bulunan bir hedef dizi ya da genin miktarını belirlemek için de uygun bir yöntemdir.
Gerçek zamanlı PCR'nin ilginç özelliği, hem amplifikasyonu hem de gerçek kantifikasyonu tek bir adımda birleştirmesidir. Bu nedenle, gerçek zamanlı PCR tekniği ile tespit için jel elektroforezi ihtiyacı ortadan kaldırılabilir. PCR reaksiyonları sırasında PCR ürünlerini etiketlemek için floresan boyaların kullanılması, sonunda doğrudan nicelleştirmeye yol açacaktır. PCR ürünleri biriktiğinde, floresan sinyalleri de toplanır ve bunlar gerçek zamanlı makine tarafından ölçülecektir. SYBR Green ve Taqman, gerçek zamanlı PCR'nin amplifikasyon sürecini algılamak veya izlemek için iki yöntemdir. Her iki yöntem de amplifikasyon sürecinin ilerlemesini izler ve ürünün miktarını gerçek zamanlı olarak bildirir.
Şekil 03: Gerçek Zamanlı PCR
Gerçek zamanlı PCR, gen ekspresyonu niceleme, mikroRNA ve kodlamayan RNA analizi, SNP genotiplendirme, kopya sayısı varyantlarının tespiti, nadir mutasyonların tespiti, genetiği değiştirilmiş organizmaların tespiti ve bulaşıcı ajanların tespiti.
Geleneksel Yuvalanmış ve Gerçek Zamanlı PCR Testleri Arasındaki Benzerlikler Nelerdir?
- İç içe ve gerçek zamanlı PCR testleri, geleneksel PCR testinin modifikasyonlarıdır.
- Üç teknik de DNA örneklerini çoğ altır.
- Ürünleri sıralama veya analizde kullanılabilir.
- Bu testler primer gerektirir.
Geleneksel Yuvalanmış ve Gerçek Zamanlı PCR Testleri Arasındaki Fark Nedir?
Konvansiyonel PCR, belirli DNA dizilerini amplifiye etmek için geliştirilmiş bir tekniktir. Bu arada, Nested PCR, iki ardışık amplifikasyon reaksiyonundan oluşan geleneksel PCR'nin bir modifikasyonudur ve gerçek zamanlı PCR, amplifiye ürünü ölçebilen geleneksel PCR'nin bir çeşididir. Bu, geleneksel iç içe ve gerçek zamanlı PCR testleri arasındaki temel farktır. Geleneksel ve gerçek zamanlı PCR'den farklı olarak iç içe PCR, iki primer seti kullanır. Ayrıca, spesifik olmayan amplifikasyonu az altmak için iç içe PCR'de iki ardışık amplifikasyon reaksiyonu vardır. ayrıca, geleneksel ve gerçek zamanlı PCR deneyleri iki sıralı amplifikasyon reaksiyonu içermez.
Aşağıdaki bilgi grafiği, yan yana karşılaştırma için geleneksel iç içe ve gerçek zamanlı PCR testleri arasındaki farkları tablo biçiminde listeler.
Özet – Konvansiyonel ve Yuvalanmış ve Gerçek Zamanlı PCR Testleri
Konvansiyonel PCR, belirli DNA parçalarını amplifiye etmek için geliştirilmiş ilk tekniktir. Yuvalanmış PCR ve gerçek zamanlı PCR, geleneksel PCR'nin iki çeşididir. Yuvalanmış PCR'de iki ardışık amplifikasyon reaksiyonu ve iki primer setinin kullanımı vardır. Gerçek zamanlı PCR, güçlendirilmiş PCR ürününü ölçmek için geliştirilmiştir. Bu nedenle, bu, geleneksel iç içe ve gerçek zamanlı PCR tahlilleri arasındaki farkı özetler.
