Anahtar Farkı – RT PCR ve QPCR
Polimeraz Zincir Reaksiyonu, DNA'nın belirli bir bölgesini in vitro olarak amplifiye etmek için kullanılan bir tekniktir. Bu tekniğin 1983'te Kary Mullis tarafından icadı sayesinde, bilim adamları araştırma amacıyla belirli DNA parçalarının binlerce ila milyonlarca kopyasını üretebiliyorlar. Şu anda klinik ve araştırma laboratuvarlarında çok çeşitli uygulamalar için yaygın ve rutin olarak uygulanan bir teknik haline gelmiştir. RT PCR, yuvalanmış PCR, multipleks PCR, Q PCR, RT – QPCR vb. gibi geleneksel PCR tekniğinin varyasyonları vardır. RT PCR ve Q PCR, PCR'nin iki önemli varyasyonudur. RT PCR ve Q PCR arasındaki temel fark, RT PCR'nin RNA'dan tamamlayıcı DNA (cDNA) transkriptleri oluşturulması yoluyla gen ekspresyonunu tespit etmek için kullanılması, Q PCR ise floresan boyalar kullanarak PCR ürünlerini gerçek zamanlı olarak nicel olarak ölçmek için kullanılmasıdır.
RT PCR nedir?
Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT PCR), RNA ekspresyonunu saptamak için kullanılan bir PCR çeşididir. Dokularda mRNA ekspresyonunu tespit etmek için çok önemli bir yöntemdir. RT PCR, örneğin başlangıç materyali RNA olduğunda kullanılır. RT PCR'de, şablon mRNA önce tamamlayıcı DNA'ya dönüştürülür. Bu adım, enzim ters transkriptaz tarafından katalize edilir ve süreç, ters transkripsiyon olarak bilinir. İkinci olarak, amplifikasyon için yeni sentezlenen cDNA için geleneksel PCR kullanılır.
RT PCR, nispeten az miktarda RNA örneği gerektiren oldukça hassas bir tekniktir. RT PCR, RNA türlerinin, özellikle insan immün yetmezlik virüsü ve hepatit C virüsü gibi RNA virüslerinin teşhisinde ve miktar tayininde yaygın olarak kullanılır.
Şekil 01: RT PCR Tekniği
QPCR nedir?
Kantitatif PCR (QPCR), PCR ürünlerini nicel olarak ölçmek için kullanılan bir PCR çeşididir. Gerçek zamanlı PCR makinesi kullanarak gerçek zamanlı amplifikasyonu ölçtüğü için gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu olarak da adlandırılır. Bir numunede bulunan bir hedef dizi veya genin miktarını belirlemek için uygun bir yöntemdir. QPCR'nin ilginç özelliği, hem amplifikasyonu hem de gerçek kantifikasyonu tek bir adımda birleştirmesidir. Bu nedenle, QPCR tekniği ile saptamada jel elektroforezi ihtiyacı ortadan kaldırılabilir. QPCR, PCR reaksiyonları sırasında PCR ürünlerini etiketlemek için floresan boyalar kullanır ve bu da sonunda doğrudan niceleme sağlar. PCR ürünleri biriktiğinde floresan sinyalleri de toplanır ve gerçek zamanlı makine ile ölçülecektir. QPCR, RT PCR ile birleştirilebilir. RT – QPCR veya QRT – PCR olarak bilinir ve hücrelerde veya dokularda RNA seviyelerinin tespiti için en güçlü, hassas ve nicel bir yöntem olarak kabul edilir.
SYBR Green ve Taqman, gerçek zamanlı PCR'nin amplifikasyon sürecini algılamak veya izlemek için kullanılan iki yöntemdir. SYBR Green yöntemi, SYBR green adı verilen bir floresan boya kullanılarak gerçekleştirilir ve boyayı çift sarmallı DNA üretmek için bağlayarak amplifikasyonu tespit eder. Taqman, çift etiketli problar kullanılarak gerçekleştirilir ve şekil 02'de gösterildiği gibi probun Taq polimeraz tarafından bozunması ve floroforun salınması yoluyla amplifikasyonu saptar. Her iki yöntem de amplifikasyon işleminin ilerlemesini izler ve ürünün miktarını gerçek zamanlı olarak bildirir..
Gerçek zamanlı PCR, gen ekspresyonu niceleme, mikroRNA ve kodlamayan RNA analizi, SNP genotipleme, kopya sayısı varyantlarının tespiti, nadir mutasyonların tespiti, genetiği değiştirilmiş organizmaların tespiti, bulaşıcı ajanların tespiti gibi çok çeşitli uygulamalara sahiptir., vb.
Şekil 02: Kantitatif PCR tekniği
RT PCR ve QPCR arasındaki fark nedir?
RT PCR ve QPCR |
|
| RT PCR, amplifikasyon yoluyla gen ifadesini tespit etmek için kullanılan bir tekniktir. | QPCR, DNA'yı çoğ altan ve PCR ürünlerini gerçek zamanlı olarak ölçen bir tekniktir. |
| Ters Transkriptaz Enziminin Tutulması | |
| Enzim ters transkriptaz, RT PCR için kullanılır. | Enzim ters transkriptaz QPCR için kullanılmaz. |
| Floresan Olarak Etiketlenmiş Moleküllerin Kullanımı | |
| Floresan etiketli boyalar veya problar RT PCR için kullanılmaz. | QPCR için floresan etiketli boyalar veya problar kullanılır. |
| PCR ürününün miktar tayini | |
| QPCR ile birleştirilmediği sürece, RT PCR, PCR ürününü nicelendirmez. | QPCR, PCR ürününü nicel olarak ölçün. |
| Başlangıç Malzemesi | |
| Başlangıç malzemesi mRNA'dır. | Başlangıç malzemesi DNA'dır. |
| cDNA sentezi | |
| Tamamlayıcı DNA RT PCR sırasında üretilir. | Tamamlayıcı DNA QPCR sırasında üretilmez. |
Özet – RT PCR ve QPCR
RT PCR ve QPCR, geleneksel PCR'nin iki versiyonudur. RT PCR tekniği mRNA örnekleri için gerçekleştirilir ve ters transkripsiyon ve cDNA üretimi ile yönlendirilir. QPCR, floresan boyalar veya etiketli problar kullanılarak gerçek zamanlı PCR termal döngüleri sırasında PCR ürünlerini ölçmek için kullanılır. QPCR'de, PCR ürününün miktarı, numune tarafından yayılan floresan sinyalleri ile temsil edilir. RT PCR, yaygın olarak bir amplifikasyon işlemi olarak kullanılırken, QPCR genellikle bir niceleme işlemi olarak kullanılır. RT PCR ve QPCR arasındaki fark budur.
