Anahtar Fark – SYBR Green vs Taqman
SYBR Green ve Taqman, gerçek zamanlı PCR'nin amplifikasyon sürecini tespit etmek veya izlemek için kullanılan iki yöntemdir. SYBR Green, interkalasyonlu nükleik asit boyama boyasına dayalı bir yöntemdir, Taqman ise hidroliz probuna dayalı bir yöntemdir. Her iki teknoloji de gerçek zamanlı PCR makinesinin reaksiyonu “gerçek zamanlı” olarak izlemesini sağlayan PCR sırasında floresan oluşturmak üzere tasarlanmıştır. SYBR Green yöntemi, SYBR green adı verilen floresan bir boya kullanılarak gerçekleştirilir ve boyayı üretilen çift sarmallı DNA'ya bağlayarak amplifikasyonu tespit eder. Taqman, çift etiketli problar kullanılarak gerçekleştirilir ve probun Taq polimeraz tarafından bozunması ve floroforun salınması yoluyla amplifikasyonu saptar. SYBR Green ve Taqman arasındaki temel fark budur.
SYBR Green nedir?
SYBR Green, Moleküler Biyolojide nükleik asitleri, özellikle çift sarmallı DNA'yı boyamak için kullanılan floresan bir boyadır. SYBR Green yöntemi, gerçek zamanlı PCR sırasında PCR ürünlerini ölçmek için kullanılır. DNA ile bağlandığında, ortaya çıkan DNA-boya kompleksi mavi ışığı emer ve yoğun yeşil ışık yayar. Çift sarmallı DNA ile bağlandıktan sonra boya molekülünde meydana gelen yapısal değişiklik nedeniyle olur. PCR gitgide daha fazla DNA oluşturduğunda, daha fazla boya molekülü DNA'ya bağlanarak daha fazla floresan üretir. Bu nedenle, PCR ürün birikimi ile floresan artar. Bu nedenle, PCR ürününün miktarı, SYBR Green floresan tespiti ile nicel olarak ölçülebilir.
SYBR yeşil boya sitometri ve floresan mikroskopisinde DNA etiketlemesi için de kullanılabilir. Etidyum bromür, jel elektroforezinde DNA görselleştirmesi sırasında atılma sorunları olan kanserojen bir boya olduğundan, etidyum bromür başarıyla SYBR Green ile değiştirildi.
SYBR yeşil yönteminin avantajları ve dezavantajları vardır. Bu yöntem çok hassas, ucuz ve kullanımı kolaydır. Bununla birlikte, herhangi bir çift sarmallı DNA'ya bağlanma yeteneği nedeniyle, spesifik olmayan bağlanma, PCR ürününün aşırı nicelenmesine yol açabilir.
Şekil 01: SYBR Yeşil Tekniği
Taqman nedir?
Taqman, gerçek zamanlı PCR sürecini izlemek için SYBR Green'e alternatif bir yöntemdir. Bu yöntem, yeni ipliğin uzatılması ve floroforun salınması sırasında probları parçalamak için Taq polimeraz enziminin 5' – 3' eksonükleaz aktivitesine bağlıdır. Bu yöntemde çift etiketli problar kullanılır ve probların hidrolizine dayanır. Problar, 5' ucunda bir floresan raportör molekülü (florofor) ve 3' ucunda bir söndürücü molekülü olan floresan etiketli DNA oligonükleo titleridir. Astar tavlarının karşı tarafındaki tek iplikli şablona bağlanacak şekilde tasarlanmıştır. Taq polimeraz, primere nükleotidler ekler ve yeni ipliği çift etiketli problara doğru uzatır. Taq polimeraz probla karşılaştığında, Taq polimerazın eksonükleaz etkisi probu aktive eder ve bozar. Yeni ipliğin sentezini tamamladıktan sonra, prob tam bozunmaya tabi tutulur ve floroforu serbest bırakır. Floroforun salınması floresan üretir. Floresan Söndürücü molekülü yayılan ışığı verimli bir şekilde söndürür ve PCR ürününün nicelleştirilmesi için çıktı oluşturur. Floroforların salınımı ve PCR ürünlerinin miktarı orantılıdır. Bu nedenle, miktar tayini Taqman yöntemiyle kolayca yapılabilir.
Şekil 02: Takman Metodu
Taqman yöntemi, gerçek zamanlı PCR, gen ekspresyonunun nicelenmesi, genetik polimorfizmlerin tespiti, kromozomal DNA delesyonlarının nicelenmesi, bakteriyel tanımlama, mikroarray analizinin doğrulanması, SNP genotipleme vb.'de kullanılır.
SYBR green ve Taqman arasındaki fark nedir?
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Green, DNA bağlayıcı boyaya dayanır. | Taqman, hibridizasyon problarına ve Taq polimerazın 5' ila 3' eksonükleaz aktivitesine bağlıdır. |
| Floresan Etiketli Problar | |
| Flüoresan etiketli prob gerekli değildir. | Çift etiketli problar gereklidir. |
| Multiplex Gen Analizi | |
| Multipleks gen hedefleri için kullanılamaz. | Multipleks gen hedefleri için kullanılabilir. |
| Maliyet | |
| Bu daha ucuz. | Bu daha pahalı. |
| Özgünlük | |
| Bu daha az spesifiktir ve herhangi bir çift zincirli DNA'ya bağlanır | Problar spesifik amplifikasyon ürünlerini tespit ettiğinden bunlar oldukça spesifiktir. |
| Etkililik | |
| Bu daha az etkilidir. | Bu oldukça etkilidir. |
| Uygulama | |
| Bu, gerçek zamanlı PCR, agaroz jel görselleştirme, DNA etiketleme vb. için kullanılır. | Bu, gerçek zamanlı PCR'de, gen ekspresyonunun nicelenmesinde, genetik polimorfizmlerin saptanmasında vb. kullanılır. |
Özet – SYBR Green ve Taqman
Taqman ve SYBR green, gerçek zamanlı PCR'de (kantitatif PCR) kullanılan iki yöntemdir. Her iki yöntem de PCR ürününün kantifikasyonunu verimli bir şekilde sağlar ve floresan emisyonuna dayanır. Taqman yöntemi, birikmiş DNA'nın tespiti için çift etiketli problar kullanırken, SYBR Green yöntemi bir floresan boya kullanır. Bu yöntemlerin her ikisi de moleküler biyolojide farklı uygulamalara sahiptir.
