Anahtar Farkı – Northern vs Southern vs Western Blot
DNA, RNA ve proteinlerin belirli dizilerinin saptanması, Moleküler biyolojideki çeşitli çalışma türleri için gereklidir. Jel elektroforezi DNA, RNA ve proteinleri boyutlarına göre ayıran bir tekniktir. Jel profillerinden, belirli DNA dizisi, RNA dizisi veya protein, blotlama ve etiketli problarla hibridizasyon adı verilen özel tekniklerle saptanır. Güney, kuzey ve batı olmak üzere üç farklı kurutma yöntemi vardır. Kuzey güney ve batı lekeleme arasındaki temel fark, bir numuneden tespit ettiği molekülün tipinde yatmaktadır. Southern lekeleme, bir DNA örneğinden belirli bir DNA dizisini tespit eden bir yöntemdir. Northern blot, bir RNA örneğinden belirli bir RNA dizisini tespit eden bir tekniktir. Western blot, bir protein örneğinden belirli bir proteini tespit eden bir yöntemdir.
Southern Blotting Nedir?
Southern blot tekniği, bir DNA örneğinden belirli bir DNA dizisinin tanımlanması için 1975 yılında E. M. Southern tarafından geliştirilmiştir. Bu, moleküler biyolojide tanıtılan ilk lekeleme tekniğidir. DNA'dan belirli genlerin, DNA'dan belirli parçaların vb. tespit edilmesini sağladı. Güney lekeleme tekniğinde birkaç adım vardır. Bunlar aşağıdaki gibidir.
- DNA numuneden izole edilir ve restriksiyon endonükleazları ile sindirilir.
- Sindirilen numune, Agaroz jel elektroforezi ile ayrılır.
- Jeldeki DNA fragmanları, bir alkali çözelti kullanılarak tek iplikçiklere denatüre edilir.
- Tek sarmallı DNA, kılcal aktarım yoluyla bir nitroselüloz filtre zarına aktarılır.
- Aktarılan DNA zara kalıcı olarak sabitlenir.
- Zar üzerindeki sabit DNA, etiketli problarla hibritlenir.
- Bağlı olmayan DNA yıkanarak zardan yıkanır.
- X-ışını filmi membrana maruz bırakılır ve bir otoradyograf hazırlanır.
Güney lekeleme moleküler biyolojinin farklı yönleri için uygulanır. RFLP haritalama, adli tıp çalışmaları, gen ifadesinde DNA metilasyonu, genetik bozukluklarda mutasyona uğramış genlerin tespiti, DNA parmak izi vb. işlemlerde faydalıdır.
Şekil 01: Southern Blot Tekniği
Northern Blot Nedir?
Northern blotting, gen ekspresyonunu incelemek için bir numuneden belirli bir RNA dizisini veya mRNA dizisini tespit etmek için tasarlanmış bir yöntemdir. Bu teknik 1979 yılında Alwine, Kemp ve Stark tarafından geliştirilmiştir. Birkaç adımdan dolayı güney ve batı lekeleme tekniklerinden farklıdır. Bununla birlikte, bu teknik ayrıca jel elektroforezi, blotlama ve spesifik etiketli problar ve algılama ile hibridizasyon yoluyla da gerçekleştirilir. Northern blot tekniği şu şekilde yapılır.
- RNA numuneden ekstrakte edilir ve jel elektroforezi ile ayrılır.
- RNA jelden bir blot membranına aktarılır ve sabitlenir.
- Zar, cDNA veya RNA'dan hazırlanan etiketli bir prob ile işlenir (prob, numunedeki belirli bir diziyi tamamlayıcıdır).
- Prob, belirli bir sekansla bağlanmak için zar ile inkübe edilir.
- Bağlı olmayan problar yıkanır.
- Hibritleştirilmiş parçalar bir otoradyograf tarafından tespit edilir.
Northern blot, hibridize mRNA'nın saptanması ve nicelenmesinde, RNA bozunmasının incelenmesinde, RNA yarı ömrünün değerlendirilmesinde, RNA eklenmesinin saptanmasında, gen ekspresyonunun incelenmesinde vb. önemli bir araçtır.
Şekil 02: Northern Blot
Western Blotting Nedir?
Western blotlama, etiketli antikor kullanarak bir protein karışımından belirli bir proteini saptama yöntemidir. Bu nedenle western blot, immünoblot olarak da bilinir. Bu teknik 1979'da Towbin ve diğerleri tarafından tanıtıldı ve şimdi protein analizi için laboratuvarlarda rutin olarak gerçekleştirilir. Adımlar aşağıdaki gibidir.
- Proteinler numuneden çıkarılır
- Proteinler poliakrilamid jel elektroforezi kullanılarak boyutlarına göre ayrılır
- Ayrılan moleküller, elektroporasyon yoluyla bir PVDF membranına veya nitroselüloz membrana aktarılır
- Zar, antikorlarla spesifik olmayan bağlanma için bloke edilir
- Aktarılan proteinler, birincil antikorla (enzim etiketli antikorlar) bağlanır.
- Zar, spesifik olmayan şekilde bağlanmış primer antikorları uzaklaştırmak için yıkanır
- Bağlı antikorlar, bir substrat eklenerek ve oluşan renkli çökelti saptanarak saptanır
Western blot, bir insan serum örneğinde anti-HIV antikorlarının saptanmasında faydalıdır. Western blot, Hepatit B enfeksiyonu için doğrulayıcı bir test ve deli dana hastalığı için kesin bir test olarak da kullanılabilir.
Şekil 03: Western Blot
Kuzey Güney ve Western Blot arasındaki fark nedir?
Northern vs Southern vs Western Blotting |
|
| Algılanan Molekül Türü | |
| Northern Blot | Northern blot, bir RNA örneğinden belirli bir RNA dizisini tespit eder. |
| Southern Blot | Güney lekeleme, bir DNA örneğinden belirli bir DNA dizisini tespit eder. |
| Western Blot | Western blot, bir protein örneğinden belirli bir proteini algılar. |
| Jel Türü | |
| Northern Blot | Bu, Agaroz/formaldehit jel kullanır. |
| Southern Blot | Bu bir Agaroz jeli kullanır. |
| Western Blot | Bu, Poliakrilamid jel kullanır. |
| Lekeleme Yöntemi | |
| Northern Blot | Bu bir kılcal transferdir. |
| Southern Blot | Bu bir kılcal transferdir. |
| Western Blot | Bu bir elektrik transferidir. |
| Kullanılan Problar | |
| Northern Blot | Radyoaktif veya radyoaktif olmayan şekilde etiketlenmiş cDNA veya RNA probları. |
| Southern Blot | DNA probları radyoaktif veya radyoaktif olmayan olarak etiketlenir. |
| Western Blot | Birincil antikorlar prob olarak kullanılır. |
| Algılama Sistemi | |
| Northern Blot | Bu, bir otoradyograf veya ışık ya da renk değişiminin tespiti kullanılarak yapılır. |
| Southern Blot | Bu, bir otoradyograf, ışık veya renk değişiminin tespiti kullanılarak yapılır. |
| Western Blot | Bu, ışığın veya renk değişiminin tespiti kullanılarak yapılır. |
Özet – Northern vs Southern vs Western Blot
Blotlama, numunelerden spesifik DNA, RNA veya proteinin tanımlanması için geliştirilmiş özel bir tekniktir. Spesifik bir molekül tipini tespit etmek için kuzey, güney ve batı olmak üzere üç ayrı lekeleme prosedürü vardır. Northern blot tekniği, bir RNA karışımından belirli bir RNA dizisini tespit etmek için tasarlanmıştır. Southern blot tekniği, bir DNA örneğinden belirli bir DNA dizisinin saptanmasını sağlar ve western blot tekniği, bir protein karışımından belirli bir proteini tanımlamak için geliştirilmiştir.
