Golden Gate ve Gibson Assembly arasındaki temel fark, Golden Gate'in klonlanacak belirli bir dizideki kısıtlama bölgelerinin varlığına dayanması, Gibson Assembly'nin ise belirli bir dizideki kısıtlama bölgelerinin varlığına güvenmemesidir. klonlanacak.
Geçtiğimiz on yıllar boyunca moleküler bilimciler, birden fazla DNA parçasının tek bir parça halinde daha kolay birleştirilmesini sağlayan çeşitli standart prosedürler geliştirdiler. Bu nedenle Restriction Enzyme Ligation, Gateway Cloning, Gibson Assembly, Golden Gate Assembly ve TOPO Cloning gibi klonlama yöntemleri araştırmacılar tarafından bilimsel deneylerde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu nedenle, Golden Gate ve Gibson Assembly, birden fazla DNA fragmanının tek bir parça halinde birleştirilmesine izin veren iki moleküler klonlama yöntemidir.
Golden Gate Montajı nedir?
Golden Gate, birden fazla DNA parçasının tek bir parça halinde birleştirilmesini kolaylaştıran moleküler bir klonlama yöntemidir. Bu yöntem, klonlanacak belirli bir dizi içindeki kısıtlama bölgelerinin varlığına dayanır. 1996 yılında ortaya çıkmıştır. Bu teknik, Tip IIS kısıtlama enzimlerini ve T4 DNA ligazını kullanır. Bu enzimler, DNA'yı tanıma bölgelerinin dışında keser. Palindromik olmayan çıkıntılar oluşturabilirler. Bu nedenle, çıkıntı dizilerinin kombinasyonları kullanılarak birden fazla DNA parçası birleştirilebilir.
Şekil 01: Altın Kapı
Golden Gate Montaj Prosedürü
Golden Gate tekniğinin prosedüründe üç ana adım vardır:
- klonlama vektöründe çıkıntıların oluşturulması,
- çıkıntılarda parçaya özgü diziler kullanılarak çoklu DNA eklerinin birleştirilmesi ve
- ligasyon.
Golden Gate montajı dairesel klonlama vektörleri (hedef vektör) kullanır. Ayrıca, bu yöntemde, sindirim ve ligasyonu aynı anda gerçekleştirmek için kısıtlama bölgesi ligatlanmış üründen elimine edilir. Golden Gate için tipik bir termal döngü protokolü 37 °C ile 16 °C arasında salınım yapar çünkü 37 °C kısıtlama enzimleri için ve 16 °C ligazlar için idealdir.
Gibson Assembly nedir?
Gibson Assembly, birden fazla DNA parçasının tek bir parça halinde birleştirilmesine izin veren bir moleküler klonlama yöntemidir. Golden Gate yönteminden farklı olarak, bu yöntem klonlanacak belirli bir dizi içinde kısıtlama bölgelerinin varlığına dayanmaz. J. Craig Venter Enstitüsü'nden Daniel G. Gibson tarafından bulundu. Bu teknik, bir dizi ve ligazdan bağımsız klonlama (SLIC) yöntemidir.
Şekil 02: Gibson Assembly
Gibson Montaj Prosedürü
Gibson Assembly, bitişik DNA fragmanlarıyla örtüşen 20-40 baz çifti içeren DNA fragmanlarına ihtiyaç duyar. Örtüşmeler PCR yoluyla eklenir. Daha sonra bu DNA parçaları, üç enzime sahip Gibson maser karışımına eklenir. Bu prosedür izotermal koşullar altında (1 saat boyunca 50 °C) üç farklı enzim kullanılarak gerçekleştirilir: eksonükleaz, DNA polimeraz ve DNA ligaz. Eksonükleaz, DNA'yı 5' ucundan geri çiğniyor. Böylece polimeraz aktivitesini inhibe etmez ve reaksiyonun tek bir işlemde ilerlemesine izin verir. Bitişik DNA parçaları üzerinde elde edilen tek iplikli bölgeler, örtüşen diziler nedeniyle tavlanabilir. DNA polimeraz, nükleotidler ekleyerek boşlukları doldurur. Son olarak, DNA ligazı, bitişik bölümlerin DNA'sına kovalent olarak katılır. Normalde Gibson Assembly, doğrusallaştırılmış hedef vektörleri kullanır. Ayrıca, bu yöntem, dizi benzerliğine dayalı olarak 15'e kadar DNA parçasını aynı anda birleştirebilir.
Golden Gate ve Gibson Assembly Arasındaki Benzerlikler
- Golden Gate ve Gibson Assembly, iki moleküler klonlama yöntemidir.
- Her iki yöntem de birden fazla DNA parçasını tek bir parçada birleştirebilir.
- Bu yöntemler hedef vektörleri kullanır.
- Her iki yöntemde birden fazla DNA parçasının birleştirilmesi için termal döngüleyiciler kullanır.
- Siteye yönelik mutajenezde kullanılırlar.
Golden Gate ve Gibson Meclisi Arasındaki Fark
Golden Gate, klonlanacak belirli bir dizideki kısıtlama bölgelerinin varlığına bağlı olarak birden fazla DNA fragmanının tek bir parça halinde birleştirilmesinde kullanılan bir moleküler klonlama yöntemidir. klonlanacak belirli bir dizi içindeki kısıtlama bölgelerinin varlığına dayanmadan çoklu DNA parçalarının tek bir parça halinde birleştirilmesi. Golden Gate ve Gibson Assembly arasındaki temel fark budur. Ayrıca, Golden Gate yöntemi dairesel bir hedef vektörü kullanırken Gibson Assembly yöntemi doğrusallaştırılmış bir hedef vektörü kullanır.
Aşağıdaki infografik, Golden Gate ve Gibson Assembly arasındaki farkı tablo halinde gösteriyor.
Özet – Golden Gate vs Gibson Assembly
Moleküler klonlama, rekombinant DNA moleküllerini bir araya getirmek ve konak organizmalar içinde replikasyonlarını yönlendirmek için kullanılan bir yöntemdir. Golden Gate ve Gibson Assembly, birden fazla DNA fragmanının tek bir parça halinde birleştirilmesine izin veren iki moleküler klonlama yöntemidir. Golden Gate yöntemi, klonlanacak belirli bir dizi içindeki kısıtlama bölgelerinin varlığına dayanırken, Gibson Assembly, klonlanacak belirli bir dizi içindeki kısıtlama bölgelerinin varlığına dayanmaz. Bu nedenle, Golden Gate ve Gibson Assembly arasındaki temel fark budur.
