Anahtar Farkı – NGS ve Sanger Sıralaması
Yeni Nesil Dizileme (NGS) ve Sanger Dizileme, zaman içinde geliştirilen iki tür nükleotid dizileme tekniğidir. Sanger Dizileme yöntemi uzun yıllardır yaygın olarak kullanılıyordu ve NGS avantajları nedeniyle son zamanlarda yerini aldı. NGS ve Sanger Dizileme arasındaki temel fark, NGS'nin bir dizileme sistemi aracılığıyla milyonlarca diziyi aynı anda hızlı bir şekilde dizileme ilkesi üzerinde çalışması, Sanger Dizileme'nin ise dideoksinükleo titlerin DNA polimeraz enzimi tarafından seçici olarak dahil edilmesi nedeniyle zincir sonlandırma ilkesi üzerinde çalışmasıdır. DNA replikasyonu sırasında ve bunun sonucunda kılcal elektroforez ile parça ayrılması.
Nükleotid Sıralaması Nedir?
Genetik bilgi, bir organizmanın DNA veya RNA'sının nükleotid dizilerinde depolanır. Belirli bir fragmanda (bir gende, gen kümesinde, kromozomda ve tam genomda) nükleo titlerin doğru sırasını (dört baz kullanarak) belirleme işlemi, nükleotit dizilimi olarak bilinir. Genomik araştırmalarda, adli araştırmalarda, virolojide, biyolojik sistematikte, tıbbi teşhiste, biyoteknolojide ve daha birçok alanda genlerin yapı ve işlevinin analiz edilmesi oldukça önemlidir. Bilim adamları tarafından geliştirilen farklı dizileme yöntemleri vardır. Bunların arasında, 1977'de Frederick Sanger tarafından geliştirilen Sanger dizilimi, Yeni Nesil Dizilemenin yerini alana kadar uzun bir süre boyunca yaygın olarak kullanıldı ve popüler hale geldi.
NGS nedir?
Yeni Nesil Dizileme (NGS), modern yüksek verimli dizileme süreçlerine atıfta bulunmak için kullanılan bir terimdir. Genomik çalışmalarda ve Moleküler Biyolojide devrim yaratan bir dizi farklı modern dizileme teknolojisini açıklar. Bu teknikler, Illumina dizileme, Roche 454 dizileme, İyon Proton dizileme ve SOLiD (Oligo Ligation Detection ile Dizileme) dizilemedir. NGS sistemleri daha hızlı ve daha ucuzdur. NGS sistemlerinde dört ana DNA dizileme yöntemi kullanılmaktadır; piro dizileme, sentez yoluyla dizileme, ligasyon yoluyla dizileme ve iyon yarı iletken dizileme. Çok sayıda DNA veya RNA dizisi (milyonlarca) paralel olarak sıralanabilir. Daha fazla zaman alan Sanger dizilemesinin aksine, organizmaların tüm genomunun kısa bir süre içinde dizilenmesine izin verir.
NGS'nin geleneksel sıralama Sanger yöntemine göre birçok avantajı vardır. Küçük bir numune boyutu ile gerçekleştirilebilen, yüksek hızlı, daha doğru ve uygun maliyetli bir işlemdir. NGS, metagenomik çalışmalarda, eklemeler ve delesyonlar vb. nedeniyle bireysel bir genom içindeki varyasyonların saptanmasında ve gen ifadelerinin analizinde kullanılabilir.
Şekil_1: NGS Dizilemesindeki Gelişmeler
Sanger Sıralaması Nedir?
Sanger Dizileme, belirli bir DNA parçasının kesin nükleotid sırasını belirlemek için 1977'de Frederick Sanger ve meslektaşları tarafından geliştirilen bir dizileme yöntemidir. Ayrıca zincir sonlandırma dizilimi veya Dideoksi dizilimi olarak da bilinir. Bu yöntemin çalışma prensibi, DNA replikasyonu sırasında ddGTP, ddCTP, ddATP ve ddTTP gibi zincir sonlandırıcı dideoksinükleo titlerin (ddNTP'ler) DNA polimeraz tarafından seçici olarak dahil edilmesiyle iplik sentezinin sonlandırılmasıdır. Normal nükleo titler, iplik oluşumunu sürdürmek için bitişik nükleo titler arasında bir fosfodiester bağının oluşumu için 3' OH gruplarına sahiptir. Bununla birlikte, ddNTP'ler bu 3' OH grubundan yoksundur ve nükleo titler arasında fosfodiester bağları oluşturamazlar. Böylece zincir uzaması durur.
Bu yöntemde, dizilenecek tek iplikli DNA, in vitro DNA sentezi için şablon iplik görevi görür. Diğer gereksinimler, oligonükleotit primeri, deoksinükleotit öncüleri ve DNA polimeraz enzimidir. Hedef parçanın yan uçları bilindiğinde, DNA replikasyonu için primerler kolaylıkla tasarlanabilir. Dört ayrı tüpte dört ayrı DNA sentez reaksiyonu gerçekleştirilir. Her tüpün diğer gereksinimleriyle birlikte ayrı ddNTP'leri vardır. Belirli nükleotitten, bir dNTP ve ddNTP karışımı eklenir. Aynı şekilde dört karışım ile dört tüpte dört ayrı reaksiyon gerçekleştirilir. Reaksiyonlardan sonra DNA fragmanlarının tespiti ve fragman paterninin dizi bilgisine dönüştürülmesi gerçekleştirilir. Elde edilen DNA parçaları ısıyla denatüre edilir ve jel elektroforezi ile ayrılır. Radyoaktif nükleotidler kullanılırsa poliakrilamid jeldeki bantlama modeli otoradyografi ile görüntülenebilir. Bu yöntem, floresan olarak etiketlenmiş dideoksinükleo titleri kullandığında, okunan jelden aşağı indirilebilir ve floresan detektör tarafından tespit edilmek üzere bir lazer ışınından geçirilebilir. Bir dizi gözle okunduğunda ve bir bilgisayara manuel olarak girildiğinde ortaya çıkabilecek hataları önlemek için, bu yöntem bilgisayarla birleştirilmiş otomatik dizileyici kullanımına dönüşmüştür.
Bu, İnsan Genom projesinden DNA dizilemek için kullanılan yöntemdir. Bu yöntem, pahalı ve yavaş bir işlem olmasına rağmen doğru sıra bilgisi verdiği için gelişmiş modifikasyonlarla hala kullanılmaktadır.
Şekil_2: Sanger Sıralaması
NGS ve Sanger Sıralaması arasındaki fark nedir?
NGS vs Sanger Sıralaması |
|
| Yeni Nesil Dizileme (NGS), modern yüksek verimli dizileme süreçlerine atıfta bulunur. Bir dizi farklı modern sıralama teknolojisini açıklar | Sanger Dizileme, belirli bir DNA parçasının kesin nükleotid sırasını belirlemek için Frederick Sanger tarafından geliştirilen bir dizileme yöntemidir. |
| Maliyet Etkinliği | |
| NGS daha ucuz bir işlemdir çünkü zamanı, insan gücünü ve kimyasalları az altır. | Zaman, insan gücü ve daha fazla kimyasal gerektirdiği için bu maliyetli bir işlemdir. |
| Hız | |
| Birçok ipliğin hem kimyasal tespiti hem de sinyal tespiti paralel gerçekleştiğinden bu daha hızlıdır. | Kimyasal algılama ve sinyal algılama iki ayrı işlem olarak gerçekleştiğinden ve aynı anda yalnızca iplik üzerinde okuma yapılabildiğinden, bu zaman alıcıdır. |
| Güvenilirlik | |
| NGS güvenilirdir. | Sanger sıralaması daha az güvenilirdir |
| Örnek Boyutu | |
| NGS daha az miktarda DNA gerektirir. | Bu yöntem büyük miktarda şablon DNA gerektirir. |
| Sıralanmış Parça Başına DNA Bazları | |
| Sıralanan parça başına DNA baz sayısı Sanger yönteminden daha düşüktür | Üretici diziler, NGS dizilerinden daha uzundur. |
Özet – NGS ve Sanger Sıralaması
NGS ve Sanger Dizileme, Moleküler Biyolojide yaygın olarak kullanılan nükleotid dizileme teknikleridir. Sanger dizileme, NGS ile değiştirilen erken bir dizileme yöntemidir. NGS ve Sanger Dizileme arasındaki temel fark, NGS'nin Sanger dizilemesinden daha yüksek hızlı, daha doğru ve uygun maliyetli bir süreç olmasıdır. Her iki teknik de Genetik ve Biyoteknolojide büyük salgınlar yarattı.
