Anahtar Farkı – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Nükleotidler, DNA'nın temel yapısal birimleri ve yapı taşlarıdır. DNA molekülü bir polinükleotid zincirinden oluşur. DNA'da bulunan dört farklı nükleotit vardır. Bu nükleo titler, A (adenin), G (guanin), C (sitozin), T (timin) adlı dört farklı azotlu bazdan oluşur. DNA molekülündeki nükleotidlerin sırası, organizmaların büyümesi ve gelişmesi için önemli bir genetik bilgiyi kodladığı için büyük önem taşımaktadır. DNA dizilimi, DNA'nın kesin nükleotid dizisini belirleyen süreci ifade eder. Farklı DNA dizileme yöntemleri vardır. Maxam Gilbert dizilimi ve Sanger DNA dizilimi, birinci nesil dizilemeye ait iki DNA dizileme yöntemidir. Maxam Gilbert dizileme prosedürü, tercihen dört nükleotid ve jel elektroforezinin her birinde 5' uç etiketli DNA fragmanlarını kimyasal olarak parçalayarak baz dizisini belirler. Sanger dizileme prosedürü, DNA polimeraz ve dideoksinükleo titler ve jel elektroforezi kullanılarak tek sarmallı DNA'yı sentezleyerek nükleotit dizisini belirler. Maxam Gilbert ve Sanger Sequencing arasındaki temel fark budur.
Maxam Gilbert Sıralaması Nedir?
Kimyasal dizileme yöntemi olarak da bilinen Maxam Gilbert dizileme, DNA'daki nükleotidlerin sırasını belirlemek için geliştirilmiş bir tekniktir. Bu yöntem W alter Gilbert ve Alan Maxam tarafından 1976 yılında tanıtılmış ve saflaştırılmış DNA ile direkt olarak uygulanabilmesi nedeniyle popüler hale gelmiştir. Maxam Gilbert yöntemi, DNA dizilemenin ilk nesline aittir ve bilim adamları tarafından yaygın olarak kullanılan ilk dizileme yöntemidir.
Bu yöntemin temel prensibi, belirli bazlardaki uç etiketli DNA fragmanlarının, baza özgü kimyasallar ve koşullar ile sınırlandırılması ve etiketli fragmanların şekil 01'de gösterildiği gibi elektroforez ile ayrılmasıdır. jel üzerindeki boyutlarına. Parçalar etiketli olduğundan, DNA molekülünün dizisi kolayca çıkarılabilir.
Maxam gilbert yöntemi, DNA'yı belirli bazlarda kırmak için baza özgü kimyasalları kullanır. Dimetil sülfat ve hidrazin kimyasalları olarak adlandırılan iki yaygın kimyasal, sırasıyla pürinlere ve pirimidinlere seçici olarak saldırmak için kullanılır.
Maxam Gilbert sıralama yöntemi aşağıdaki gibi birkaç adımla gerçekleştirilir.
- DNA dizisinin restriksiyon endonükleazları kullanılarak saflaştırılması
- Radyoaktif fosfatlar ekleyerek DNA fragmanlarının uçlarının etiketlenmesi
- Etiketli parçaların jel elektroforezi ile etiketlenmemiş parçalardan saflaştırılması
- Son etiketli DNA'nın dört tüpe ayrılması ve baza özel kimyasallarla ayrı ayrı işlenmesi
- Her tüpün içeriğinin jel üzerinde ayrı hatlar üzerinde elektroforezi ve uzunluklarına göre fragman ayrılması.
- Parçaların otoradyografi ile tespiti.
Şekil 01: Maxam Gilbert Dizileme
Sanger Sıralaması Nedir?
Sanger Dizileme, belirli bir DNA parçasının baz dizisini belirlemek için 1977'de Frederick Sanger ve meslektaşları tarafından geliştirilen bir dizileme yöntemidir. Zincir sonlandırma sıralama veya Dideoksi sıralama yöntemi olarak da bilinir. Bu yöntem, zincir oluşumunu sonlandırmak için tek sarmallı DNA'nın sentezi sırasında ddGTP, ddCTP, ddATP ve ddTTP gibi zincir sonlandırıcı dideoksinükleo titlerin (ddNTP'ler) DNA polimeraz tarafından seçici olarak dahil edilmesi ilkesine göre çalışır. Dideoksinükleo titler, bitişik nükleotit ile fosfodiester bağlarının oluşumu için 3' OH gruplarına sahip değildir. Bu nedenle, sanger dizilimi sırasında yeni oluşan diziye bir ddNTP eklendiğinde iplik oluşumu durur.
Bu yöntemde, tek tip ddNTP ile dört ayrı tüpte dört ayrı DNA sentez reaksiyonu (PCR) gerçekleştirilir. Primerler, dNTP'ler, Taq polimeraz, özel koşullar vb. dahil olmak üzere PCR tüpleri için başka gereksinimler de sağlanır. Dört karışımla dört tüpte dört ayrı reaksiyon gerçekleştirilir. PCR reaksiyonlarından sonra, elde edilen DNA fragmanları ısıyla denatüre edilir ve jel elektroforezi ile ayrılır. Daha sonra parçalar, etiketli (radyoaktif veya flüoresan) bir primer veya şekil 02'de gösterildiği gibi dNTP'ler kullanılarak görselleştirilir.
Şekil 02: Sanger Sıralaması
Maxam Gilbert ve Sanger Sequencing arasındaki fark nedir?
Maxam Gilbert vs Sanger Sıralaması |
|
| Maxam Gilbert dizileme, DNA dizileme için geliştirilmiş ilk tekniktir. | Sanger dizileme yöntemi, Maxam Gilbert dizileme yönteminden sonra tanıtıldı. |
| Kullanım | |
| Bu yöntem nadiren kullanılır. | Sanger sıralama, sıralama için rutin olarak kullanılır. |
| Tehlikeli Kimyasalların Kullanımı | |
| Tehlikeli kimyasallar kullanır. | Tehlikeli kimyasalların kullanımı Maxam Gilbert yöntemine göre sınırlıdır. |
| Algılama için Etiketleme | |
| Bu yöntem, DNA parçalarının uçlarını etiketlemek için radyoaktif P32 kullanır. | Sanger dizileme, radyoaktif veya floresan etiketli ddNTP'ler kullanır. |
Özet – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Maxam Gilbert ve Sanger dizilimi, birinci nesil DNA dizilimine giren iki tür DNA dizileme tekniğidir. Maxam Gilbert dizileme, 1976'da DNA dizileme için tanıtılan ilk yöntemdir ve uç etiketli DNA parçalarının baza özgü kimyasallarla kırılmasıyla gerçekleştirilir. Bu nedenle, kimyasal sıralama olarak bilinir. Sanger dizileme yöntemi 1977'de tanıtıldı ve ddNTP tarafından yönlendirilen zincir sonlandırma reaksiyonlarına dayanmaktadır. Sanger dizileme yöntemi, Maxam Gilbert yönteminin aşırı zaman tüketimi, tehlikeli kimyasalların kullanımı vb. gibi çeşitli dezavantajları nedeniyle Maxam Gilbert yönteminden popülerdir. Maxam Gilbert ve Sanger dizilemesi arasındaki fark budur.
