Anahtar Farkı – Gen Klonlama ve PCR
Belirli bir DNA fragmanından DNA'nın birçok kopyasının sentezine DNA amplifikasyonu denir. Gen klonlama ve PCR olmak üzere iki ana DNA amplifikasyon süreci vardır. Gen klonlama ve PCR arasındaki temel fark, gen klonlama, rekombinant bir DNA oluşturarak ve bir konakçı bakteri içinde büyüyerek belirli bir genin çoklu kopyalarını in vivo üretirken, PCR, tekrarlanan döngülerden geçen in vitro belirli bir DNA fragmanının milyonlarca kopyasını üretir. denatürasyon ve sentez.
Gen Klonlama Nedir?
Gen klonlama, bir organizmanın ekstrakte edilmiş genomik DNA'sından, rekombinant DNA'nın oluşturulması yoluyla belirli bir geni bulmak ve çoğ altmak için kullanılan bir tekniktir. Genomik DNA, proteinler için kodlanmış binlerce farklı gen içerir. DNA ekstrakte edildiğinde, taşıyabileceği tüm olası genleri içerir. Gen klonlama tekniği, toplam DNA'dan belirli bir genin saptanmasını sağlamıştır. Bu nedenle gen klonlama moleküler biyolojide önemli bir araç olarak hizmet eder.
Bir organizmanın genomik kütüphanesinin oluşturulması, ilgili genin DNA'daki yeri hakkında bir ipucu yoksa, gen klonlamada esastır. Aşağıdaki adımlar kullanılarak bir genomik kitaplık oluşturulur.
Adım 1: İstenen geni içeren bir organizmadan toplam DNA'nın çıkarılması.
Adım 2: Küçük yönetilebilir parçalar üretmek için ekstrakte edilmiş DNA'nın kısıtlayıcı sindirimi. Bu adım, kısıtlama endonükleazları tarafından kolaylaştırılır.
Adım 3: Uygun bir vektörün seçilmesi ve aynı kısıtlama endonükleazlarını kullanarak vektör DNA'sının açılması. Bakteriyel plazmitler yaygın olarak yabancı DNA'yı taşımak için vektörler olarak kullanılır. Plazmitler, bakterilerin içinde bulunan küçük DNA halkalarıdır.
Adım 4: Rekombinant DNA molekülü üretmek için vektör DNA ve parçalanmış DNA'nın birleştirilmesi. Bu adım, DNA ligaz tarafından yönetilir.
Adım 5: Rekombinant DNA moleküllerinin konakçı bakterilere aktarılması. Bu adım dönüşüm olarak bilinir ve bir ısı şoku kullanılarak yapılır.
Adım 5: Bir kültür ortamında dönüştürülmüş bakteri hücrelerinin taranması. Dönüştürme işleminin sonunda, dönüştürülmüş ve dönüştürülmemiş konukçu hücrelerin karışık bir popülasyonu elde edilir. İlgi konusu gen sadece transforme edilmiş konakçı hücreleri içerdiğinden. Bu nedenle, dönüştürülmüş hücreleri seçmek gereklidir. Seçim, antibiyotik içeren seçici besiyeri kullanılarak yapılır. Seçimi sağlayan bu tarama ortamında yalnızca dönüştürülmüş hücreler büyür.
Adım 6: Bir gen kütüphanesi oluşturmak için bakteri büyütme. Bu adımda, dönüştürülmüş konakçı hücreler, optimum büyüme gereksinimlerini sağlayan taze kültür ortamına dahil edilir. Kültür plakalarındaki toplam koloniler, o organizmanın genomik kütüphanesini temsil eder.
Adım 7: İlgili geni içeren rekombinant DNA molekülü, binlerce klonlanmış rekombinant DNA fragmanından taranmalıdır. Spesifik geni veya o genden gelen spesifik protein sonuçlarını işaretleyen problar kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Bakteri kolonisini içeren ilgili gen, toplam kolonilerden tanımlandıktan sonra, geni içeren rekombinant plazmitin milyonlarca kopyasını yapmak mümkündür.
Gen klonlama, gen kütüphanelerinin oluşturulmasında, özel proteinlerin, vitaminlerin, antibiyotiklerin, hormonların üretilmesinde, organizmaların genomlarının dizilenmesinde ve haritalanmasında, adli tıpta bireylerin DNA'sının birden çok kopyasının oluşturulmasında kullanılır.
Şekil_1: Gen Klonlama
PCR nedir?
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), belirli bir DNA parçasının çok sayıda kopyasını oluşturan bir tekniktir. Spesifik bir DNA dizisinin üstel amplifikasyonu, in vitro koşullar altında PCR ile elde edilir. Bu teknik, küçük bir DNA örneğini kullanılabilir bir miktarda çoğ altabildiği için Moleküler Biyolojide çok güçlü bir araçtır. PCR 1983 yılında Kary Mullis tarafından tanıtıldı ve bu ödüllü buluş Moleküler Biyolojide büyük bir ilerleme sağladı.
PCR tekniği, Şekil 02'de gösterildiği gibi tekrarlanan PCR reaksiyonlarını takip eder. Bir PCR reaksiyonu, üç farklı sıcaklıkta meydana gelen üç ana adımdan oluşur; 94 0C'de DNA'da çift sarmallı denatüre etme, 68 0C'de primerlerin tavlanması ve 72 0'da iplik uzaması C. Bu nedenle, PCR gerçekleştirildiğinde, uygun replikasyon için sıcaklık dalgalanması yüksek oranda korunmalıdır. PCR, PCR tüplerinin içindeki bir PCR makinesinde gerçekleştirilir. PCR tüpleri, şablon DNA, Taq polimeraz, primerler, dNTP'ler ve tampon içeren doğru PCR karışımları ile yüklenir. Çift sarmallı numune DNA'sının tek sarmallı DNA'ya denatüre edilmesi, tamamlayıcı bazlar arasındaki hidrojen bağlarının 94 – 98 0C'de kırılmasıyla yapılır. Daha sonra şablon DNA'nın tek iplikleri primerler için açığa çıkar. Bir çift primer (ileri ve geri) sağlanmalı ve bunlar yüksek sıcaklıkları tolere etmek için termostabil olmalıdır. Primerler, hedef DNA fragmanının uçlarını tamamlayan tek sarmallı kısa DNA dizileridir. PCR'de sentetik primerler kullanılır. Primerler, örnek DNA'nın tamamlayıcı bazlarına bağlanır ve yeni bir ipliğin sentezini başlatır. Bu adım, Taq polimeraz adı verilen bir enzim tarafından katalize edilir; Thermus auqaticus'tan izole edilen termostabil bir DNA polimeraz enzimi. Primerler ve nükleo titler (yapı taşları) mevcut olduğunda, Taq polimeraz, şablon DNA'ya tamamlayıcı olan yeni DNA zincirini oluşturur. PCR programının sonunda, jel elektroforezi kullanılarak amplifiye edilmiş DNA fragmanı gözlemlenir. Daha fazla analiz gerekirse, PCR ürünü jelden saflaştırılır.
PCR, genetik ve edinilmiş hastalıkların teşhisi ve izlenmesi, suçluların belirlenmesi (adli tıp alanında), hedeflenen bir DNA segmentinin yapısını ve işlevini incelemek, organizmaların genomlarının dizilenmesi ve haritalanması için çok faydalıdır. vb. PCR, çok çeşitli uygulamalara sahip olması nedeniyle bilim adamları arasında tıbbi ve moleküler biyoloji araştırma laboratuvarlarında rutin bir laboratuvar tekniği haline gelmiştir.
Şekil_2: Polimeraz Zincir Reaksiyonu
Gen Klonlama ve PCR arasındaki fark nedir?
Gen Klonlama ve PCR |
|
| Gen klonlama, rekombinant DNA aracılığıyla belirli bir genin in vivo olarak birden çok kopyasını oluşturma ve bir konakçı bakteriye dönüştürme işlemidir. | PCR tekniği, tekrarlanan PCR reaksiyonları döngüleri yoluyla in vitro belirli bir DNA dizisinin çoklu kopyalarını üretir. |
| Rekombinant DNA Oluşturma Gereksinimi | |
| Geni bulmak için rekombinant DNA üretilir. | Rekombinant DNA üretilmez. |
| Emek İhtiyacı | |
| Bu süreç emek yoğun. | Yoğun emek gerekli değildir. |
| In vivo veya In vitro süreç | |
| Rekombinant DNA yapımı in vitro ve DNA amplifikasyonu in vivo. | DNA amplifikasyonu tamamen in vitro gerçekleşir. |
Özet – Gen Klonlama ve PCR
Gen klonlama ve PCR, DNA amplifikasyonu için kullanılan iki yöntemdir. PCR, rekombinant DNA ve bir konakçı organizma kullanmadan belirli bir DNA parçasının DNA'sının birden çok kopyasını oluşturan in vitro bir işlemdir. Gen klonlama, esas olarak, rekombinant DNA'nın oluşturulması yoluyla konakçı organizma içinde ilgili bir genin çoklu kopyalarıyla sonuçlanan in vivo bir süreçtir. Gen klonlama ve PCR arasındaki fark budur.
