Anahtar Fark – Nitroselüloz ve PVDF
Western blot, bir protein örneğinden belirli proteinlerin saptanmasına ve nicelenmesine izin veren bir yöntemdir. Tekniğin güvenilirliği jelden proteinlerin absorpsiyonu için doğru membranın seçimine bağlıdır. Mikro gözenekli membranların farklı türleri vardır. Nitroselüloz ve PVDF membranlar, diğer membran türlerine göre özel nitelikleri nedeniyle araştırmacılar tarafından tercih edilen bu tür iki membrandır. Nitroselüloz veya PVDF arasındaki seçim de western blotlamada başka bir zorluktur. Hem nitroselüloz hem de PVDF, yüksek protein absorpsiyon kapasitesine sahiptir. Nitroselüloz ve PVDF membran arasındaki temel fark, nitroselüloz membranların antikorları soyma ve membranı antikor yeniden probu için yeniden kullanma yeteneğine sahip olmaması, PVDF membranların ise soyma ve yeniden kullanma yeteneği olmasıdır.
Nitroselüloz nedir?
Nitroselüloz, selülozun nitrik asit ile işlenmesiyle üretilen bir polimerdir ve moleküler biyolojide, özellikle güney, kuzey ve batı lekeleme gibi lekeleme teknikleri için mikro gözenekli membranlar yapmak için kullanılır. Nitroselüloz membranların gözenek boyutları 3 ila 20 µm arasındadır. Nitroselüloz mikro gözenekli membranlar, membran yüzeyinde meydana gelen immünokimyasal reaksiyonun tespitini kolaylaştırır. Bu nedenle nitroselüloz membranlar, western blotlamada proteinlerin immobilizasyonu ve spesifik proteinlerin tespiti için sıklıkla kullanılır. Nitroselüloz membranlar ayrıca glikoproteinleri ve nükleik asitleri hareketsiz hale getirebilir.
Nitroselüloz membranlar, çeşitli özelliklerinden dolayı yanal akış deneylerinde tercih edilir. Nitroselüloz membranlar proteinleri yüksek konsantrasyonda emer. Membranı ıslatmak için kullanılan solvent nitroselüloz membran protein emilimini az altmaz. Nitroselüloz membranlar istenilen jel boyutuna kolayca kesilebilir ve proteinleri jelden membrana elektrik veya kılcal transfer ile aktarabilir. Nitroselüloz, yüksek bağlanma potansiyeli ile zardan proteinlerin daha hızlı akışına izin verir. Nitroselüloz, geliştirilmiş bir kullanım gücü gösterir. Nitroselüloz membranın bir diğer özel özelliği, solvent olmayan suya dayanıklı yapıştırıcılarla çeşitli plastik arkalıklara kolayca yapıştırılabilmesidir.
Şekil 01: Western blotlama için nitroselüloz membran
PVDF nedir?
Poliviniliden diflorür (PVDF), viniliden diflorürün polimerizasyonuyla üretilen floropolimerdir ve proteinlerin yüksek immobilizasyon kabiliyetine sahiptir. Bu nedenle, PVDF'den yapılan mikro gözenekli membranlar, protein karışımlarından belirli proteinleri analiz etmek için western blot tekniklerinde kullanılır. PVDF membranları, amino asit analizi ve protein dizilimi için de kullanılabilir. PVDF membranın nitroselüloz membran üzerindeki en önemli özelliği, antikorlardan kolayca sıyrılabilmesi ve sonraki antikor probları için yeniden kullanılabilmesidir.
PVDF membranları nitroselüloz membranlardan daha kalındır; dolayısıyla yeniden kullanım sırasında oluşabilecek hasarlara karşı daha dayanıklıdır. PVDF membranları oldukça hidrofobiktir. Bu nedenle, kullanımdan önce metanol veya izopropanol içinde ıslatılmalıdırlar.
Nitroselüloz ve PVDF arasındaki fark nedir?
Nitroselüloz vs PVDF |
|
| Nitroselüloz, selülozdan oluşan bir polimerdir. | PVDF, viniliden diflorürün polimerizasyonuyla üretilen bir floropolimerdir. |
| Membran Gözenek Boyutu | |
| Tipik gözenek boyutları 0.1, 0.2 veya 0.45μ | Tipik gözenek boyutları 0.1, 0.2 veya 0.45μm'dir |
| Protein Bağlama Kapasitesi | |
| Nitroselüloz 80 ila 100 μg/cm'lik bir protein bağlama kapasitesine sahiptir2. | PVDF, 170 ila 200 μg/cm2 protein bağlama kapasitesine sahiptir. |
| Hassasiyet | |
| Bu, PVDF'ye kıyasla düşük bir duyarlılığa sahiptir. | Bunun hassasiyeti yüksektir. |
| Düşük Eksprese Edilen Proteinlerin Tespiti | |
| Nitroselüloz membranlarda duyarlılık düşük olduğu için düşük eksprese edilen proteinlerin tespiti için uygun değildir. | Bu, yüksek duyarlılığı nedeniyle düşük düzeyde eksprese edilen proteinlerin tespiti için daha uygundur. |
| Arka Plan Gürültüsü | |
| Bunun arka plan gürültüsü daha düşük | Bunun arka plan gürültüsü daha yüksek. |
| Proteinlerle Etkileşimler | |
| Protein molekülleri hidrofobik etkileşimler yoluyla nitroselüloz membranlara bağlanır. | Proteinler, hidrofobik ve dipol etkileşimleri yoluyla PVDF membranlarına bağlanır. |
| Zarın Doğası | |
| Nitroselüloz kırılgan ve kırılgandır. Ancak nitroselülozun versiyonları mevcuttur ve bunlar dirençlidir. | PVDF daha dayanıklıdır ve daha yüksek kimyasal dirence sahiptir. |
| Soyunma ve Yeniden Kullanım Yeteneği | |
| Nitroselüloz, sinyali kaybetmeden sıyırma ve yeniden problamada zorluk çekebilir. | PVDF, uygulamaları yeniden sorgulama ve sıralama için idealdir. |
| Uygunluk | |
| Nitroselüloz, düşük moleküler ağırlıklı proteinleri tespit etmek için idealdir. | PVDF, daha yüksek moleküler ağırlıklı proteinleri tespit etmek için daha uygundur. |
| Diğer Kullanımlar | |
| Nitroselüloz, nükleik asit analizi ve nokta/slot lekeleme için kullanılabilir. | PVDF, protein dizileme ve katı faz tahlil sistemleri için kullanılabilir. |
| Maliyet | |
| Bu, PVDF membranlardan daha ucuzdur. | Bu, nitroselüloz membranlardan daha pahalıdır. |
| Ön ıslatma ihtiyacı | |
| Nitroselüloz membranlar metanol ile ön ıslatma gerektirmez | PVDF membranları metanol ile önceden ıslatma gerektirir. |
Özet – Nitroselüloz vs PVDF
Nitroselüloz membranlar, yanal akış testi için ticari olarak kullanılan ilk membranlardı. Proteinleri absorbe etme kapasiteleri yüksektir. Bu nedenle western blotlamada nitroselüloz membranlar kullanılır. PVDF, western blotlamada kullanılan başka bir zar türüdür ve aynı zamanda yüksek protein absorpsiyon kapasitesine sahiptir. Her iki tip de protein analizi için western blotlamada kullanılır. Bununla birlikte, PVDF membranlarının daha özel nitelikleri vardır, bu da onları western blotlama için nitroselüloz membranlardan daha uygun hale getirir. Ancak nitroselüloz membranlar düşük moleküler ağırlıklı proteinlerin tespiti için daha uygundur, PVDF membranlar ise yüksek moleküler ağırlıklı proteinlerin tespiti için daha uygundur. Nitroselüloz ve PVDF membranları arasındaki fark budur.
