Anahtar Farkı – Nick Çevirisi ve Primer Uzantısı
Nick translasyonu ve primer uzatma, Moleküler biyolojide gerçekleştirilen iki önemli tekniktir. temel fark, nick translasyonu ve primer uzantısı arasındaki temel fark, nick translasyon işleminin diğer hibridizasyon teknikleri için etiketli problar üretmesidir, primer uzatma yöntemi ise bir karışımdan belirli bir RNA dizisini tanımlar ve mRNA'nın ifadesi hakkında bilgi verir. Her iki tekniğin de büyük önemi vardır ve moleküler araştırma laboratuvarlarında rutin olarak gerçekleştirilir.
Nick Çeviri Nedir?
Nick translasyonu, lekeleme, in situ hibridizasyon, floresan in situ hibridizasyon vb. gibi çeşitli moleküler biyolojik teknikler için etiketli problar hazırlamak için kullanılan önemli bir tekniktir. DNA etiketlemenin in vitro bir yöntemidir. DNA probları, spesifik DNA veya RNA dizilerini tanımlamak için kullanılır. Etiketli bir prob yardımıyla, karmaşık bir nükleik asit karışımından spesifik fragmanlar işaretlenebilir veya görselleştirilebilir. Bu nedenle, farklı teknikler için kullanılmak üzere çeşitli teknikler kullanılarak etiketli problar hazırlanır. Nick çevirisi, DNase 1 ve DNA polimeraz 1 enzimlerinin yardımıyla etiketli problar üreten böyle bir yöntemdir.
nick çeviri süreci DNase 1 enzim aktivitesi ile başlar. DNase 1, nükleo titler arasındaki fosfodiester bağlarını parçalayarak çift sarmallı DNA'nın fosfat omurgasına çentikler sokar. Nick oluşturulduktan sonra, nükleotidin serbest 3' OH grubu verilecek ve DNA polimeraz 1 enzimi bunun üzerinde hareket edecektir. DNA polimeraz 1'in 5' ila 3' eksonükleaz aktivitesi, nükleo titleri DNA zincirinin 3' yönüne doğru çentikten uzaklaştırır. Aynı zamanda, DNA polimeraz 1 enziminin polimeraz aktivitesi çalışır ve çıkarılan nükleo titlerin yerine nükleo titler ekler. Nükleo titler etiketlenmişse, değiştirme etiketli nükleo titler tarafından gerçekleşecek ve DNA'yı tanımlama için işaretleyecektir. Bu yeni sentezlenmiş etiketli DNA, Moleküler Biyolojide çeşitli hibridizasyon reaksiyonlarında prob olarak kullanılabilir.
Şekil 01: Nick çeviri işlemi
Astar Uzantısı nedir?
Primer uzantısı, bir RNA karışımından spesifik RNA dizisini bulmak ve mRNA transkriptinin 5' ucunu bulmak için kullanılan bir tekniktir. Ayrıca RNA'nın yapısını ve ekspresyonunu incelemek için kullanılır. Primer uzatma yöntemi, etiketli primerler veya etiketli nükleotidler ile gerçekleştirilir. Etiketli primerler kullanılırsa, cDNA sentezi için kullanılan nükleotidlerin etiketlenmesi ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu teknikte birkaç adım vardır. Örnekten RNA ekstraksiyonu ile başlar. Ardından, belirli bir RNA dizisinin cDNA'sını sentezlemek için gerekli bileşenlerle birlikte karışıma etiketli bir oligonükleotit primeri eklenir. Karışımdan tamamlayıcı dizi ile astar tavlanır. Şablon olarak primer tavlanmış diziyi kullanarak, enzim ters transkriptaz, RNA dizisinin tamamlayıcı DNA'sını (cDNA) sentezler. Primer tavlama ve ters transkripsiyon, yalnızca numunede spesifik RNA dizisi mevcut olduğunda meydana gelir. Son olarak, denatüre jel elektroforezi gerçekleştirildiğinde, RNA dizisinin boyutu belirlenebilir. Primer uzatma yöntemiyle mRNA (transkripsiyon başlatma bölgesi) dizisinin +1 bazını bulmak da kolaydır. Numunede bulunan mRNA miktarı, fazla primer kullanılıyorsa bu yöntemle ölçülebilir.
Şekil 02: Primer uzantısı
Nick Translation ve Primer Extension arasındaki fark nedir?
Nick Çeviri ve Primer Uzantısı |
|
| Nick çevirisi, çeşitli hibridizasyon reaksiyonları için etiketli DNA probları oluşturan bir işlemdir. | Primer uzantısı, spesifik RNA'yı bulmak veya gen ekspresyonunu incelemek için kullanılan bir tekniktir. |
| Kullanılan Enzimler | |
| DNase 1 ve DNA polimeraz enzimleri kullanılır. | Ters transkriptaz enzimi kullanılır. |
| Önem | |
| Nick çevirisi, spesifik DNA dizisinin işaretlenmesini kolaylaştırır. | Primer uzantısı, spesifik mRNA dizi boyutunun ve numunede bulunan miktarın saptanmasını sağlar. |
Özet – Nick Çevirisi ve Primer Uzantısı
Nick translasyonu, DNase 1 ve E coli DNA polimeraz 1 enzimlerinin aktivitelerine dayalı olarak etiketli probları sentezlemek için kullanılan bir yöntemdir. Farklı hibridizasyon teknikleri öncesinde laboratuvarlarda uygulanan in vitro bir yöntemdir. Nick translasyonu sırasında, DNA polimeraz 1'in 5'-3' eksonükleaz aktivitesi, nickin önündeki nükleo titleri uzaklaştırır ve DNA polimeraz 1'in polimeraz aktivitesi, çıkarılan nükleo titleri, nickin arkasındaki etiketli nükleo titlerle değiştirir. Primer uzatma, bir karışımdan belirli bir RNA transkriptini tespit etmek ve ilgilenilen RNA'nın boyutunu ve miktarını ölçmek için kullanılan bir yöntemdir. Bu, nick çevirisi ve primer uzantısı arasındaki farktır.
