Anahtar Farkı – PCR ve DNA Dizilimi
PCR ve DNA dizilimi Moleküler Biyolojide iki önemli tekniktir. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), bir DNA parçasının çok sayıda kopyasını oluşturan işlemdir. DNA dizilimi, belirli bir DNA parçasının nükleotidlerinin kesin sıralamasıyla sonuçlanan tekniktir. PCR ve DNA dizilimi arasındaki temel fark budur. PCR, DNA dizilemesinde yer alan en önemli adımlardan biridir.
PCR nedir?
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), Moleküler Biyolojide kullanılan bir DNA amplifikasyon tekniğidir. Belirli bir DNA parçasının binlerce ila milyonlarca kopyasını üretir. Bu yöntem 1983 yılında Kary Mullis tarafından geliştirilmiştir. Bu teknikte amplifiye edilecek DNA parçası şablon görevi görür ve DNA polimeraz enzimi PCR karışımında bulunan primere tamamlayıcı nükleotidler ekler. PCR reaksiyonunun sonunda, numune DNA'sının birçok kopyası sentezlenir.
DNA, DNA polimeraz (Taq polimeraz), primerler (ileri ve ters primerler), nükleotidler (DNA'nın yapı taşları) ve bir tampon dahil olmak üzere PCR karışımının farklı bileşenleri vardır. PCR, bir PCR makinesinin içinde gerçekleşir ve makineye doğru PCR karışımı yüklenmeli ve doğru program çalıştırılmalıdır. Bu teknik, çok az miktarda DNA'dan belirli bir DNA bölümünün binlerce ila milyonlarca kopyasının üretilmesini sağlar.
PCR reaksiyonları, bir jel üzerinde görünür miktarda PCR ürünü üretmek için döngüsel bir şekilde meydana gelir. Şekil 01'de gösterildiği gibi bir PCR reaksiyonunda yer alan denatürasyon, primer tavlama ve iplik uzatma olmak üzere üç ana adım vardır. Bu üç adım, üç farklı sıcaklıkta gerçekleşir. DNA, tamamlayıcı bazlar arasındaki hidrojen bağları ile çift sarmallı biçimde bulunur. Uygulamadan önce, çift sarmallı DNA birbirinden ayrılmalıdır. Yüksek ısı verilerek yapılır. Yüksek sıcaklıkta, çift sarmallı DNA, tek sarmallara denatüre olur. Daha sonra primerler, spesifik fragmanın veya DNA geninin yan uçlarına yaklaşmalıdır. Primer, hedef diziye tamamlayıcı olan kısa bir tek iplikli DNA parçasıdır. İleri ve ters primerler, denatüre numune DNA'sının yan uçlarındaki tamamlayıcı bazlarla tavlama sıcaklığında tavlanır. Astarlar ısıya dayanıklı olmalıdır. Primerler örnek DNA ile tavlandığında, taq polimeraz enzimi, hedef DNA'ya tamamlayıcı olan nükleotidleri ekleyerek yeni ipliklerin sentezini başlatır. Taq polimeraz, Thermus aquaticus adlı termofilik bir bakteriden izole edilen, ısıya dayanıklı bir enzimdir. PCR tamponu, taq polimeraz eylemi için optimal koşulları korur. PCR reaksiyonlarının bu üç aşaması, gerekli miktarda PCR ürünü üretmek için tekrarlanır. Her PCR reaksiyonundan sonra DNA kopyası sayısı ikiye katlanır. Bu nedenle, PCR'de üstel bir amplifikasyon gözlemlenebilir. PCR ürünleri jel elektroforezi kullanılarak gözlemlenebilir ve daha ileri çalışmalar için saflaştırılabilir.
Şekil 01: Bir PCR Reaksiyonunun Başlıca Adımları
PCR, tıbbi ve biyolojik araştırmalarda değerli bir araçtır. PCR, suçlulardan alınan küçük örneklerden yapılan çalışmalar için DNA'yı çoğ altabildiği ve adli DNA profilleri oluşturabildiği için adli bilimde özel bir değere sahiptir. PCR, genotipleme, gen klonlama, mutasyon tespiti, DNA dizileme, DNA mikrodizileri ve babalık testi vb. dahil olmak üzere moleküler biyolojinin birçok alanında yaygın olarak kullanılmaktadır.
Şekil 02: Polimeraz Zincir Reaksiyonu
DNA Dizileme Nedir?
DNA dizilimi, belirli bir DNA fragmanındaki adenin, guanin, sitozin ve timin gibi nükleotidlerin kesin bir sırasının belirlenmesidir. Genetik bilgi, nükleotidlerin doğru sırası kullanılarak DNA dizilerinde saklanır. Bu nedenle, bir DNA fragmanındaki nükleotidlerin kesin sırasını bulmak, genlerin yapısı ve işlevi hakkında bilgi sahibi olmak için çok önemlidir.
DNA dizileme protokolü farklı süreçleri içerir. İlk adım, bir organizmanın ilgili DNA'sının veya genomik DNA'sının izolasyonudur. PCR kullanılarak (yukarıda açıklandığı gibi), DNA'nın istenen bölgesi çoğ altılmalıdır. Amplifiye edilmiş PCR ürünü jel elektroforezi ile ayrılmalı ve saflaştırılmalıdır. Amplifiye fragmanlar, sıralama için şablonlar olarak sunulur. Sıralama, Sanger dizileme veya yüksek verimli dizileme yöntemi izlenerek yapılabilir. Sanger dizilimi, elde edilen DNA parçalarının kılcal elektroforezini gerektirir. Doğru nükleotid sırasının belirlenmesi, otoradyografların manuel olarak okunması veya otomatik DNA dizileyicileri kullanılarak yapılabilir.
Gen dizileme, İnsan genomu projesine katkıda bulundu ve 2003 yılında insan genomunun haritalanmasını kolaylaştırdı. Adli tıpta, DNA dizileme, benzersiz DNA dizileri gösteren ve suçluları tanımlayan bireylerin tanımlanmasını sağladı. Tıpta, DNA dizilemesi, genetik ve diğer hastalıklardan sorumlu genleri tespit etmek, kusurlu genleri bulmak ve bunları doğru genlerle değiştirmek için kullanılabilir. Tarımda, bazı mikroorganizmaların DNA dizileme bilgileri, ekonomik olarak istenen özelliklere sahip transgenik mahsuller üretmek için kullanılır.
Şekil 03: DNA Dizileme
PCR ve DNA Dizileme arasındaki fark nedir?
PCR ve DNA Dizilimi |
|
| PCR işlemi, ilgili DNA parçasının binlerce ila milyonlarca kopyasını oluşturur. | DNA dizilimi, belirli bir DNA fragmanındaki nükleotidlerin kesin sırasını belirleme işlemidir. |
| Sonuç | |
| PCR, belirli bir DNA parçasının binlerce ila milyonlarca kopyasını oluşturur | Bu, belirli bir DNA parçasındaki bazların doğru sıralanmasıyla sonuçlanır. |
| ddNTP'lerin katılımı | |
| PCR, ddNTP gerektirmez. dNTP'leri kullanır. | DNA dizilemesi, iplik oluşumunu sonlandırmak için ddNTP'leri gerektirir. |
Özet – PCR ve DNA Dizilimi
PCR ve DNA dizilimi, Moleküler Biyolojinin birçok alanında çok önemli araçlardır. DNA fragmanlarının amplifikasyonu PCR tekniği ile yapılırken, bir DNA fragmanının nükleo titlerinin doğru sırası DNA dizilimi ile belirlenir. Bu, PCR ve DNA dizilimi arasındaki farktır.
