Anahtar Farkı – Sanger Sıralaması vs Pyrosequencing
DNA dizilimi, DNA analizi için çok önemlidir, çünkü belirli bir DNA bölgesindeki doğru nükleotid dizilimi bilgisi, onun hakkında birçok önemli bilgiyi ortaya çıkarır. Farklı DNA dizileme yöntemleri vardır. Sanger dizileme ve Pyrosequencing, Moleküler Biyolojide yaygın olarak kullanılan iki farklı DNA dizileme yöntemidir. Sanger dizilimi ile Pyrosequencing arasındaki temel fark, Sanger dizilimi, nükleotid dizisini okumak için DNA sentezini sonlandırmak için dideoksinükleo titleri kullanırken, piro dizileme, nükleo titleri dahil ederek ve dizinin kesin sırasını okumak için tamamlayıcı diziyi sentezleyerek pirofosfat salınımını tespit eder.
Sanger Sıralaması Nedir?
Sanger dizilimi, 1977'de Frederick Sanger ve kolejleri tarafından geliştirilen birinci nesil DNA dizileme yöntemidir. Dideoksinükleotidler (ddNTP'ler) tarafından zincir sonlandırılmasına dayandığından Zincir Sonlandırma Dizilimi veya Dideoksi dizilimi olarak da bilinir. Bu yöntem, Yeni Nesil Dizileme (NGS) geliştirilinceye kadar 30 yılı aşkın bir süredir yaygın olarak kullanılıyordu. Sanger dizileme tekniği, doğru nükleotid düzeninin keşfini veya belirli bir DNA parçasının bağlanmasını sağladı. ddNTP'lerin seçici olarak dahil edilmesine ve in vitro DNA replikasyonu sırasında DNA sentezinin sonlandırılmasına dayanır. Bitişik nükleo titler arasında fosfodiester bağ oluşumunu sürdürmek için 3' OH gruplarının olmaması, ddNTP'lerin benzersiz bir özelliğidir. Bu nedenle, ddNTP bir kez eklendiğinde, zincir uzaması o noktadan sona erer ve sona erer. Sanger dizilemesinde kullanılan dört ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP ve ddTTP - vardır. Bu nükleo titler, büyüyen DNA zincirine dahil edildiklerinde DNA replikasyon sürecini durdurur ve değişen uzunluklarda kısa DNA ile sonuçlanır. Kılcal jel elektroforezi, bu kısa DNA ipliklerini Şekil 01'de gösterildiği gibi bir jel üzerinde boyutlarına göre düzenlemek için kullanılır.
Şekil 1: Sentezlenen kısa DNA'nın kılcal jel elektroforezi
DNA'nın in vitro replikasyonu için birkaç gereksinim sağlanmalıdır. Bunlar DNA polimeraz enzimi, şablon DNA, oligonükleotid primerleri ve deoksinükleotidlerdir (dNTP'ler). Sanger dizilemesinde, DNA replikasyonu dört ayrı test tüpünde ve dört tip ddNTP'de ayrı ayrı gerçekleştirilir. Deoksinükleo titler, ilgili ddNTP'ler tarafından tamamen değiştirilmez. Belirli dNTP'nin bir karışımı (örneğin; dATP + ddATP) tüpe dahil edilir ve çoğ altılır. Dört ayrı tüp ürünü, dört ayrı kuyuda bir jel üzerinde çalıştırılır. Daha sonra jeli okuyarak dizi, Şekil 02'de gösterildiği gibi oluşturulabilir.
Şekil 02: Sanger dizilimi
Sanger dizileme moleküler biyolojinin birçok alanında yardımcı olan önemli bir tekniktir. Sanger dizileme tabanlı yöntemler yardımıyla insan genom projesi başarıyla tamamlandı. Sanger dizileme aynı zamanda hedef DNA dizilimi, kanser ve genetik hastalık araştırmaları, gen ekspresyon analizi, insan tanımlaması, patojen tespiti, mikrobiyal dizileme vb. için de yararlıdır.
Sanger dizilemenin birkaç dezavantajı vardır:
- Sıralanan DNA'nın uzunluğu 1000 baz çiftinden uzun olamaz
- Aynı anda yalnızca bir dizi sıralanabilir.
- Süreç zaman alıcı ve pahalıdır.
Bu nedenle, bu sorunların üstesinden gelmek için zamanla yeni gelişmiş sıralama teknikleri geliştirildi. Bununla birlikte, Sanger dizilimi, yaklaşık 850 baz çifti uzunluğundaki parçaya kadar son derece doğru sonuçları nedeniyle hala kullanılmaktadır.
Pyrosequencing nedir?
Pyrosequencing, "sentez yoluyla dizileme"ye dayalı yeni bir DNA dizileme tekniğidir. Bu teknik, nükleotid eklenmesi üzerine pirofosfat salınımının saptanmasına dayanır. İşlem dört farklı enzim tarafından kullanılır: DNA polimeri, ATP sülfülaz, lusiferaz ve apiraz ve iki substrat adenosin 5' fosfosülfat (APS) ve lusiferin.
Süreç, tek iplikli DNA şablonu ile primer bağlanmasıyla başlar ve DNA polimeraz, ona tamamlayıcı nükleotidlerin dahil edilmesini başlatır. Nükleotidler birleştiğinde (nükleik asit polimerizasyonu), pirofosfat (birbirine bağlı iki fosfat grubu) gruplarını ve enerjiyi serbest bırakır. Her nükleotid ilavesi, eşmolar miktarda pirofosfat salmaktadır. Pirofosfat, substrat APS varlığında ATP sülfürülaz tarafından ATP'ye dönüşür. Üretilen ATP, lusiferinin oksilusiferine lusiferaz aracılı dönüşümünü yürütür ve ATP'lerin miktarıyla orantılı miktarlarda görünür ışık üretir. Işık, bir foton algılama cihazı veya fotoçoğ altıcı tarafından algılanır ve bir pirogram oluşturur. Apiraz, reaksiyon karışımında ATP'yi ve dahil olmayan dNTP'leri bozar. dNTP eklemesi birer birer yapılır. Nükleotidin eklenmesi, ışığın dahil edilmesi ve saptanmasına göre bilindiğinden, şablonun dizisi belirlenebilir. Pirogram, Şekil 03'te gösterildiği gibi numune DNA'sının nükleotid dizisini oluşturmak için kullanılır.
Pyrosequencing, tek nükleotid polimorfizm analizinde ve kısa DNA dizilerinin dizilenmesinde çok önemlidir. Yüksek doğruluk, esneklik, otomasyon kolaylığı ve paralel işleme, pyrosequencing'in Sanger sıralama tekniklerine göre avantajlarıdır.
Şekil 03: Pyrosequencing
Sanger Dizileme ile Pyrosequencing arasındaki fark nedir?
Sanger Sıralaması vs Pyrosequencing |
|
| Sanger dizileme, ddNTP'lerin DNA polimeraz tarafından seçici olarak dahil edilmesine ve zincir sonlandırmasına dayanan bir DNA dizileme yöntemidir. | Pyrosequencing, nükleotidin dahil edilmesi üzerine pirofosfat salınımının saptanmasına dayanan bir DNA dizileme yöntemidir. |
| ddNTP kullanımı | |
| ddNTP'ler DNA replikasyonunu sonlandırmak için kullanılır | ddNTP'ler kullanılmaz. |
| İlgili enzimler | |
| DNA polimeraz kullanılır. | Dört enzim kullanılır: DNA polimeraz, ATP sülfirilaz, Lusiferaz ve Apiraz. |
| Kullanılan Substratlar | |
| APS ve Luciferin kullanılmaz. | Adenozin 5' fosfosülfat (APS) ve lusiferin kullanılır. |
| Maksimum Sıcaklık | |
| Bu yavaş bir işlemdir. | Bu hızlı bir işlemdir. |
Özet – Sanger Sıralaması vs Pyrosequencing
Sanger dizileme ve Pyrosequencing, moleküler biyolojide kullanılan iki DNA dizileme yöntemidir. Sanger dizileme, zincir uzamasını sona erdirerek dizideki nükleo titlerin sırasını oluştururken, piro dizileme, nükleo titlerin dahil edilmesi ve pirofosfatların salınımını tespit ederek dizideki nükleo titlerin kesin sırasını oluşturur. Bu nedenle, Sanger dizileme ile Pyrosequencing arasındaki temel fark, Sanger dizilemenin zincir sonlandırması ile dizileme üzerinde çalışması, pyrosequencing'in sentez yoluyla dizileme üzerinde çalışmasıdır.
