Anahtar Farkı – Mikroarray ve RNA Dizileme
Transkriptome, mRNA, rRNA, tRNA, bozulmuş RNA ve bozulmamış RNA dahil olmak üzere bir hücrede bulunan RNA'nın tüm içeriğini temsil eder. Transkriptomun profillenmesi, hücre içgörülerini anlamak için önemli bir süreçtir. Transkriptome profil oluşturma için birkaç gelişmiş yöntem vardır. Mikrodizi ve RNA dizilimi, transkriptomu analiz etmek için geliştirilmiş iki tür teknolojidir. Mikrodizi ve RNA dizilimi arasındaki temel fark, mikrodizinin önceden tasarlanmış etiketli probların hedef cDNA dizileriyle hibridizasyon potansiyeline dayanması, RNA dizilemesinin ise NGS gibi gelişmiş dizileme teknikleriyle cDNA dizilerinin doğrudan dizilenmesine dayanmasıdır. Mikrodizi, diziler hakkında ön bilgi ile gerçekleştirilir ve RNA dizilemesi, diziler hakkında önceden bilgi olmadan gerçekleştirilir.
Mikrodizi nedir?
Microarray, bilim adamları tarafından transkriptom profili oluşturmak için kullanılan sağlam, güvenilir ve yüksek verimli bir yöntemdir. Transkript analizi için en popüler yaklaşımdır. Hibridizasyon problarına bağlı olan düşük maliyetli bir yöntemdir.
Teknik, numuneden mRNA'nın çıkarılması ve toplam RNA'dan cDNA kitaplığının oluşturulmasıyla başlar. Daha sonra katı bir yüzey (nokta matrisi) üzerinde floresan etiketli önceden tasarlanmış problarla karıştırılır. Tamamlayıcı diziler, mikrodizideki etiketli problarla hibritleşir. Daha sonra mikrodizi yıkanır ve taranır ve görüntü nicelenir. Göreli ifade profillerini elde etmek için toplanan veriler analiz edilmelidir.
Mikrodizi problarının yoğunluğunun, numunedeki transkript miktarıyla orantılı olduğu varsayılır. Bununla birlikte, tekniğin doğruluğu tasarlanan problara, diziye ilişkin ön bilgilere ve probların hibridizasyon için afinitesine bağlıdır. Bu nedenle mikroarray teknolojisinin sınırlamaları vardır. Mikroarray tekniği, düşük bolluklu transkriptlerle gerçekleştirilemez. İzoformları ayırt etmede ve genetik varyantları tanımlamada başarısız olur. Bu yöntem probların hibridizasyonuna bağlı olduğu için mikroarray tekniğinde çapraz hibridizasyon, nonspesifik hibridizasyon vb. hibridizasyonla ilgili bazı problemler ortaya çıkmaktadır.
Şekil 01: Mikrodizi
RNA Dizileme Nedir?
RNA av tüfeği dizilimi (RNA dizilimi), yakın zamanda geliştirilmiş bir tam transkriptom dizileme tekniğidir. Transkriptome profil oluşturmanın hızlı ve yüksek verimli bir yöntemidir. Doğrudan genlerin ifadesini nicelleştirir ve transkriptomun derinlemesine araştırılmasına neden olur. RNA dizilimi, önceden tasarlanmış problara veya dizilerin önceden bilinmesine bağlı değildir. Bu nedenle, RNA seq yöntemi, yeni genleri ve genetik varyantları tespit etme konusunda yüksek hassasiyete ve yeteneğe sahiptir.
RNA dizileme yöntemi birkaç adımda gerçekleştirilir. Hücrenin toplam RNA'sı izole edilmeli ve parçalanmalıdır. Daha sonra ters transkriptaz kullanılarak bir cDNA kütüphanesi hazırlanmalıdır. Her cDNA dizisi adaptörlerle bağlanmalıdır. Daha sonra bağlanan fragmanlar amplifiye edilmeli ve saflaştırılmalıdır. Son olarak bir NGS yöntemi kullanılarak cDNA'nın dizilenmesi gerçekleştirilmelidir.
Şekil 02: RNA Dizileme
Mikrodizi ve RNA dizileme arasındaki fark nedir?
Microarray vs RNA Dizileme |
|
| Microarray, sağlam, güvenilir, yüksek verimli bir yöntemdir. | RNA dizileme, doğru ve yüksek verimli bir yöntemdir. |
| Maliyet | |
| Bu düşük maliyetli bir yöntemdir. | Bu pahalı bir yöntemdir. |
| Çok Sayıda Örneğin Analizi | |
| Bu, çok sayıda örneğin aynı anda analiz edilmesini kolaylaştırır. | Bu, çok sayıda örneğin analiz edilmesini kolaylaştırır. |
| Veri Analizi | |
| Veri analizi karmaşıktır. | Bu yöntemde daha fazla veri üretilir; dolayısıyla süreç daha karmaşıktır. |
| Sıralarla İlgili Ön Bilgiler | |
| Bu yöntem hibridizasyon problarına dayanmaktadır, bu nedenle diziler hakkında önceden bilgi gereklidir. | Bu yöntem önceki dizi bilgisine bağlı değildir. |
| Yapısal Varyasyonlar ve Yeni Genler | |
| Bu yöntem, yapısal varyasyonları ve yeni genleri tespit edemez. | Bu yöntem, gen birleştirme, alternatif ekleme ve yeni genler gibi yapısal varyasyonları tespit edebilir. |
| Hassasiyet | |
| Bu, izoformların ifadesindeki farklılıkları tespit edemez, dolayısıyla bu sınırlı bir duyarlılığa sahiptir. | Bunun hassasiyeti yüksektir. |
| Sonuç | |
| Bu yalnızca göreceli ifade düzeyleriyle sonuçlanabilir. Bu, gen ifadesinin mutlak miktarını vermez. | Mutlak ve göreceli ifade seviyeleri verir. |
| Veri Yeniden Analizi | |
| Yeniden analiz etmek için bunun yeniden çalıştırılması gerekiyor. | Sıralama verileri yeniden analiz edilebilir. |
| Belirli Personel ve Altyapı İhtiyacı | |
| Mikrodizi için özel altyapı ve personel gerekmez. | RNA dizilimi için gereken özel altyapı ve personel. |
| Teknik Sorunlar | |
| Mikroarray tekniğinde çapraz hibridizasyon, spesifik olmayan hibridizasyon, tek tek probların sınırlı algılama oranı vb. gibi teknik sorunlar vardır. | RNA seq tekniği, çapraz hibridizasyon, spesifik olmayan hibridizasyon, tek tek probların sınırlı algılama oranı vb. gibi teknik sorunları önler. |
| Önyargılar | |
| Hibridizasyona bağlı olduğu için bu önyargılı bir yöntemdir. | Mikrodiziye kıyasla önyargı düşüktür. |
Özet – Mikroarray ve RNA Dizileme
Microarray ve RNA dizileme yöntemleri, transkriptome profil oluşturma için geliştirilmiş yüksek verimli platformlardır. Her iki yöntem de gen ekspresyon profilleri ile yüksek oranda ilişkili sonuçlar üretir. Bununla birlikte, RNA dizilimi, gen ekspresyon analizi için mikrodiziye göre avantajlara sahiptir. RNA dizilimi, düşük bolluklu transkriptlerin tespiti için mikrodiziden daha hassas bir yöntemdir. RNA dizilimi ayrıca izoformlar arasındaki farklılaşmayı ve gen varyantlarının tanımlanmasını sağlar. Bununla birlikte, RNA dizilimi, veri depolama zorlukları ve karmaşık veri analizi ile yeni ve pahalı bir teknik olduğundan, mikrodizi çoğu araştırmacının ortak seçimidir.
