Anahtar Farkı – PCR Primerleri ve Sekans Primerleri
Moleküler biyoloji alanındaki son gelişmelerle birlikte, konunun farklı yollarının araştırma süreçlerini kolay ve doğru hale getiren farklı genetik teknikler geliştirildi. PCR ve diğer sıralama prosedürleri, bu tür iki önemli tekniktir. Farklı alt bileşenler kullanırlar. Primerler, hem PCR hem de Sıralama tekniklerinde ortak olan ana alt bileşen olarak kabul edilir. PCR primerleri belirli bir DNA sekansının amplifikasyonu için kullanılırken sekanslama primerleri, nükleotid sekansının spesifik sırasını ortaya çıkarmak amacıyla bir DNA fragmanının sekanslanması bağlamında kullanılır. Bu, PCR primerleri ile sıralama primerleri arasındaki temel farktır.
PCR Primerleri nelerdir?
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), moleküler biyoloji alanında belirli bir DNA segmentinin tek veya birkaç kopyasını amplifiye etmek ve milyonlarca özdeş kopya elde etmek için kullanılan genetik bir tekniktir. Bir PCR reaksiyonunda, primerler dahil olmak üzere farklı bileşenler kullanılır. Primerler, amplifiye edilecek DNA fragmanlarının başlangıç ve bitiş bölgesi ile uyumlu olmalarını sağlayan, 18-25 nükleotid uzunluğuna sahip kısa DNA zincirleridir. Astarlar bir ileri astar ve ters astar olabilir. Bu primerler, DNA polimerazın belirli bir yerde spesifik primere bağlanmasını sağladığı belirli noktalarda DNA fragmanına bağlanır ve yeni DNA zincirinin sentezini başlatır.
Primer seçimi, PCR işleminin önemli bir yönüdür. Astarın uzunluğunun seçimi önemlidir. İdeal uzunluk 18-25 nükleotit olacaktır. Uzunluk çok kısa veya çok uzunsa, primerler doğru bir şekilde amplifiye edilecek DNA dizisine bağlanmayacaktır. Uzunluğu çok kısa olan primerler, DNA dizisinin farklı konumlarında spesifik olmayan primer tavlamasına yol açar.
Şekil 01: PCR Primerleri
İyi bir primerdeki Guanin ve Sitozin (GC) içeriği 40-60 aralığında olmalıdır. Primer tavlama sıcaklığı ve erime sıcaklığı, PCR sırasında hayati faktörlerdir. Erime sıcaklığı doğru bir şekilde hesaplanmalı ve primer tavlama sıcaklığı erime sıcaklığından 5 0C daha düşük olmalıdır. Erime sıcaklığı 60 °C ve 75 °C olmalıdır. Çok yüksek veya çok düşük sıcaklıklar daha az aktif DNA polimeraz aktivitesine neden olur.
Sıralama Primerleri nelerdir?
Sekanslama primerleri, spesifik kimliğini ortaya çıkarmak amacıyla bir DNA fragmanının sekanslanması bağlamında kullanılır. İyi sıralama sonuçları elde etmek için yüksek kaliteli primerler ve şablonlar önemlidir. Bu nedenle, primerler seçildiğinde, dizilemek istediğimiz belirli bir bölgeye özgü olmalıdırlar. Ayrıca, dizilerin genellikle primerlerin 3' ila 5' uçlarından oluşturulduğu doğru bir yönlendirme ile olmalıdır. Dizi, saç tokası ilmeklerinin oluşumu gibi istenmeyen kendi kendine melezleşmeden yoksun olmalıdır. Guanin bazlarının ardışık oluşumunu içermemelidir.
Astarın erime sıcaklığı (Tm) dizileme koşulları için uygun olmalıdır. Bu nedenle, 52oC ve 74oC arasında olmalıdır. Bir primer olarak kullanılacak oligonükleo titlerin hazırlanması, dizinin istenen tam uzunluğunu elde etmek için saflaştırılmalıdır. Oligonükleotidler safsızlıklar içeriyorsa, farklı hazırlama bölgelerinden gelen primer dizi sinyali üst üste bindirilecek ve bu aynı zamanda baz hücrelerinin sayısını da az altacaktır.
Şekil 02: Sıralama Primerleri
Bir oligonükleotidin primer erime sıcaklığı (Tm), tamamlayıcı DNA ipliklerinin birbirleriyle ne kadar güçlü hibridize olduğunu belirler. Tm, hem DNA dizilerine hem de tuz konsantrasyonu gibi çeşitli koşullara bağlı olduğu bir termodinamik hesaplama olarak düşünülebilir. Tm, dideoksinükleotid ile sonlandırılmış bir grup parça üretmek için döngü dizilimi olarak adlandırılan bir varyantın kullanıldığı PCR sırasında önemlidir. Burada, dizilenen primer alternatif olarak başlangıçta tavlanacak, daha sonra uzatılacak ve son olarak amplifikasyon için denatüre edilecektir. Bu nedenle Tm değeri 52oC ile 74o C arasında olmalıdır. seçim. DNA dizilimi için kullanılan küçük sentez ölçeği genellikle 50 nmol'dür. Ayrıca en önemlisi dizileme için kullanılan primerler kalite düşüşünü önleyecek safsızlıklardan arındırılmalıdır.
PCR Primerleri ve Sekanslama Primerleri Arasındaki Benzerlikler Nelerdir?
- Hem PCR Primerleri hem de Sekanslama Primerleri, hedeflenen bir DNA sekansının amplifikasyon sürecinde kullanılan primerlerdir.
- Hem PCR Primerleri hem de Sekanslama Primerleri nükleo titlerden oluşur.
- Hem PCR Primerleri hem de Sekanslama Primerleri kısa oligomerlerdir.
PCR Primerleri ile Sekanslama Primerleri Arasındaki Fark Nedir?
PCR Primerleri vs Sekans Primerleri |
|
| PCR primerleri, amplifiye edilecek DNA fragmanlarının başlangıç ve bitiş bölgeleriyle uyumlu olmalarını sağlayan, 18-25 nükleotid dizi uzunluğuna sahip kısa DNA zincirleridir. | Sekanslama primerleri, spesifik kimliğini ortaya çıkarmak amacıyla bir DNA fragmanını sıralama bağlamında kullanılan kısa oligomerlerdir. |
| İşlev | |
| PCR primerleri, belirli bir DNA dizisinin amplifikasyonu için kullanılır. | Sekanslama primerleri, belirli kimliğini ortaya çıkarmak amacıyla bir DNA fragmanının sekanslanması bağlamında kullanılır. |
| Gerekli primer sayısı | |
| İki astar; PCR primerleri olarak bir ileri primer ve bir ters primer kullanılır. | Sıralama primeri olarak yalnızca bir primer gerekir. |
Özet – PCR Primerleri ve Sekanslama Primerleri
Sekanslama primerleri, belirli kimliğini ortaya çıkarmak amacıyla bir DNA fragmanının sekanslanması bağlamında kullanılır. İşlemi çalıştırmak için bir sıralama primeri yeterli olacaktır. İyi sıralama sonuçları elde etmek için yüksek kaliteli primerler ve şablonlar önemlidir. Bu nedenle, primerler seçildiğinde, dizilemek istediğimiz belirli bir bölgeye özgü olmalıdırlar. PCR Primerleri, amplifiye edilecek DNA fragmanlarının başlangıç ve bitiş bölgesi ile uyumlu, nükleotid uzunluğu 18-25 olan kısa DNA zincirleridir. PCR primerleri bir ileri primer ve ters primer olabilir. İyi bir primerdeki Guanin ve Sitozin (GC) içeriği 40-60 aralığında olmalıdır. Primer tavlama sıcaklığı ve erime sıcaklığı, PCR sırasında hayati önem taşıyan hususlardır. Bu, PCR primerleri ile Sekanslama primerleri arasındaki farktır.
