Anahtar Fark – Sıcak ve Soğuk Tripsinizasyon
Sıcak ve Soğuk Tripsinizasyon, hayvan hücresi kültüründe hücrelerin enzimatik ayrıştırılmasında kullanılan iki yöntemdir. Sıcak ve soğuk tripsinizasyon arasındaki temel fark, adından da anlaşılacağı gibi, hücresel ayrıştırma için tripsinin eklendiği sıcaklığa bağlıdır. Sıcak tripsinizasyon daha yüksek sıcaklık koşullarında (36.5 – 37 0C) gerçekleşirken, soğuk tripsinizasyon düşük sıcaklık koşullarında gerçekleşir.
Hayvan hücrelerinin birincil hücre kültürü işlemi sırasında, kullanılan ve başarılı olduğu kanıtlanan üç ana yöntem vardır. Üç yöntem, hücrelerin mekanik olarak ayrıştırılmasını, hücrelerin enzimatik olarak ayrıştırılmasını ve birincil eksplant tekniğini içerir. Hücrelerin izolasyonuna yol açan hücrelerin enzimatik ayrışması, protein parçalayıcı enzim tripsin tarafından yapılır. Bu nedenle, bu işlem Trypsinization olarak bilinir. Tripsinizasyon, Sıcak Tripsinizasyon ve Soğuk Tripsinizasyon olmak üzere iki farklı koşulda yapılabilir. Sıcak tripsinizasyon, 36.5 – 37 0C sıcaklıkta sıcak koşullar altında hücrelerin tripsin ile muamele edilmesi yöntemidir. Soğuk tripsinizasyon, daha soğuk koşullar altında, tercihen çok düşük sıcaklıkları koruyan buzda gerçekleşen tripsin tedavisi sürecidir.
Sıcak Tripsinizasyon Nedir?
Tripsinizasyon, birincil hücre kültürü üretmek üzere hücreleri izole etmek amacıyla hücresel bileşenleri ayrıştırmak için yapılabilir. Tripsin, bir protein bozunma enzimidir ve tripsinizasyonda kullanılan enzim karışımı, ham bir özüt veya saflaştırılmış bir ürün olabilir. Ham özütün, diğer parçalayıcı enzimleri içerdiği için protein parçalanması ve hücre parçalanmasında daha etkili olduğu söylenir.
Sıcak tripsinizasyon, daha yüksek sıcaklık koşullarında gerçekleşen hücre ayrıştırması için en yaygın kullanılan enzimatik yöntemdir. Tripsinizasyon ile tedaviden önce istenilen doku daha küçük parçalara bölünür. Kolay ayrıştırma işlemini kolaylaştırır. Kıyılmış doku daha sonra Diseksiyon Bazal Tuz ortamı olarak bilinen özel bir ortamda yıkanır.
Yıkama aşamasının tamamlanmasının ardından hücreler, tripsin olan aktif enzimi içeren bir şişeye dönüştürülür. Bu teknik, sıcak bir tripsinizasyon protokolü gerektirdiğinden, tripsin yaklaşık dört saat boyunca yaklaşık 37 0C sıcaklıkta tutulur.
Şekil 01: Tripsin
İçerikler, protokolün kolaylığı ve ayrıştırma sürecini hızlandırmak için santrifüj yöntemleri kullanılarak karıştırılır ve çalkalanır. Önerilen süreye ulaşıldığında, hücreler süpernatandan türetilebilir. Süpernatandan türetilen hücreler daha sonra belirli bir sıcaklık ve zamanda inkübe edilir.
Soğuk Tripsinizasyon Nedir?
Soğuk tripsinizasyon, soğuk koşullar altında gerçekleşen diğer bir tripsinizasyon türüdür. Bu teknikte, doğranmış ve yıkanmış hücreler buz üzerinde şişelere konur ve ardından tripsin ile ıslatılır. Islatma süresi çok daha uzundur – yaklaşık 6 – 24 saat.
Islatma prosedürünün tamamlanmasından sonra, tripsin hücre lizatından çıkarılır ve doku parçaları 37 0C'de yaklaşık 20 – 30 dakika daha inkübe edilir. Hücrelerin ayrıştırılması, doku karışımının tekrar tekrar pipetlenmesiyle sağlanır. Bu, hücrelerin zardan ayrılmasını ve süpernatana gelmesini sağlayacaktır. Hücreler süpernatant içinde olduğunda, inkübe edilir ve istenen sıcaklık ve zaman periyodunda büyütülür.
Soğuk tripsinizasyon yönteminin birçok avantajı vardır
- Hücre hasarı en aza indirildiğinden daha yüksek canlı hücre verimi. Santrifüjleme adımları kullanılmayarak hücre hasarı en aza indirilir.
- Son derece uygun yöntem.
- Daha az zahmetli.
Soğuk tripsinizasyon yönteminin ana sınırlaması, büyük miktarların tek bir örnekte kullanılamamasıdır.
Sıcak ve Soğuk Tripsinizasyon Arasındaki Benzerlikler Nelerdir?
- Hem Ilık hem de Soğuk Tripsinizasyon işlemleri, hücrelerin ayrıştırılması için tripsin enzimini kullanır.
- Hücrelerin ayrıştırılması için hücre kültürü prosedürlerinde hem Sıcak hem de Soğuk Tripsinizasyon işlemleri kullanılır.
- Hem Ilık hem de Soğuk Tripsinizasyon tedavi prosedürlerinde hücreler süpernatandan türetilir.
Sıcak ve Soğuk Tripsinizasyon Arasındaki Fark Nedir?
Sıcak ve Soğuk Tripsinizasyon |
|
| Sıcak tripsinizasyon, 36,5 – 37 derecelik bir sıcaklıkta, sıcak koşullar altında hücrelerin tripsin ile tedavi edilmesi yöntemidir 0. | Soğuk tripsinizasyon, daha soğuk koşullar altında, tercihen buzda, çok düşük sıcaklıkları koruyarak gerçekleşen tripsin tedavisi sürecidir. |
| Protokol | |
| Doğranmış doku parçaları, prosedür boyunca sürekli olarak 37 0C'de tutulur. | Doğranmış doku parçaları başlangıçta buz gibi soğuk sıcaklıklarda tutulur ve ardından 37°C'de tutulur 0. |
| Sıcaklık | |
| Sıcak tripsinizasyon 36.5 – 37'de gerçekleşir 0 | Soğuk tripsinizasyon, buz gibi soğuk sıcaklıklarda gerçekleşir. |
| Tüketilen Zaman | |
| Sıcak tripsinizasyon işleminin tamamı (yaklaşık 4 saat) için daha az süre gerekir. | Soğuk tripsinizasyon için daha uzun süre gerekir (yaklaşık 6 – 24 saat). |
| Yaşayan Hücrelerin Verimi | |
| Sıcak tripsinizasyon oranı düşük. | Soğuk tripsinizasyonda yüksek. |
| Santrifüjlemenin Kullanımı | |
| Sıcak tripsinizasyonda hücrelerin ayrıştırılması için santrifüj gereklidir. | Soğuk tripsinizasyonda santrifüj gerekli değildir. |
| Tripsinizasyon için İlk Doku Miktarı | |
| Ilık tripsinizasyonda daha büyük miktarda doku kullanılabilir. | Soğuk tripsinizasyonda daha az miktarda doku kullanılabilir. |
| Hücre Hasarı | |
| Sıcak tripsinizasyonda santrifüjleme nedeniyle yüksek. | Soğuk tripsinizasyon nedeniyle daha az. |
Özet – Sıcak ve Soğuk Tripsinizasyon
Tripsinizasyon, hücre kültürü işlemi sırasında birincil hücre kültürlerinin ayrıştırılması ve hazırlanması için protein parçalayıcı enzim tripsin kullanma yöntemidir. İşlem sırasında kullanılan sıcaklıklara dayalı olarak iki ana tripsinizasyon tekniği vardır. Bunlar sıcak ve soğuk tripsinizasyondur. Sıcak tripsinizasyon 37 0C'de gerçekleştirilir, soğuk tripsinizasyon ise buz gibi soğuk koşullar altında gerçekleştirilir. Soğuk tripsinizasyonun tamamlanması daha uzun sürse de, daha yüksek canlı hücre verimine sahip olduğu söylenir. Bunun nedeni, kuvvetli santrifüjleme adımları kullanmadığı için soğuk tripsinizasyonda hücre hasarının en aza indirilmesidir. Bu, sıcak ve soğuk tripsinizasyon arasındaki farktır.
