Anahtar Fark – RAPD ve RFLP
Genetik belirteçler, bireyler ve türler arasındaki genetik varyasyonları tanımlamak için Moleküler Biyoloji'de kullanılır. Rastgele Güçlendirilmiş Polimorfik DNA (RAPD) ve Kısıtlama Parça Uzunluğu Polimorfizmi (RFLP), laboratuvarlarda rutin olarak kullanılan iki önemli moleküler belirteçtir. RAPD, kısa ve keyfi oligonükleotid primerleri ile gerçekleştirilir ve organizmanın şablon DNA'sı boyunca çoklu konumların rastgele amplifikasyonuna dayanır. RFLP, spesifik bir restriksiyon endonükleaz ile gerçekleştirilir ve elde edilen restriksiyon fragmanlarının polimorfizmine ve hibridizasyona dayanır. RAPL ve RFLP arasındaki temel fark, RAPD'nin önceki dizi bilgisi olmadan gerçekleştirilen bir PCR tekniği türü olması, oysa RFLP'nin PCR'ye dahil olmaması ve tekniği gerçekleştirmek için önceden dizi bilgisi gerektirmesidir.
RAPD nedir?
RAPD, moleküler biyolojide faydalı bir moleküler belirteçtir. Hızlı ve kolay bir tekniktir. RAPD, hedef DNA şablonunun çoklu konumlarının rastgele amplifikasyonunun bir sonucu olarak polimorfik DNA dizileriyle sonuçlanan bir yöntem olarak tanımlanabilir. RAPD, PCR amplifikasyonu için rastgele dizilere sahip kısa oligonükleotid primerleri kullanır. Primerler, ön dizi bilgisi olmadan yapay olarak sentezlenir. Bu nedenle kolay ve kullanışlı bir teknik olarak kabul edilir.
Aşağıdaki ana adımlar RAPD'de yer almaktadır.
- Hedef DNA'nın çıkarılması
- Rastgele seçilmiş primerler kullanılarak hedef DNA'nın çoklu konumlarının amplifikasyonu
- Güçlendirilmiş PCR ürünlerinin jel elektroforezi
- Etidyum bromür ile boyama ve polimorfizmin tanımlanması
Astar tavlamasındaki varyasyonun bir sonucu olarak, amplifikasyon sırasında farklı uzunluklarda farklı fragmanlar üretilir. Bu nedenle, jeller üzerindeki bant desenleri bireyler ve türler arasında farklıdır. Böylece RAPD, tanımlama ve farklılaşmada organizmalar arasındaki genetik çeşitliliğin saptanmasını sağlar.
RAPD, yakın akraba türler arasındaki genetik farklılığın tanımlanması, gen haritalaması, DNA parmak izi, kalıtsal hastalıkların tanımlanması gibi çeşitli moleküler biyoloji çalışmalarında uygulanır.
Şekil 01: RAPD
RFLP nedir?
Kısıtlama Parçası Uzunluğu Polimorfizmleri (RFLP'ler), homolog DNA dizilerindeki genetik varyasyonun tanımlanması için moleküler biyolojide kullanılan moleküler bir işaretçidir. DNA parmak izi için geliştirilmiş ilk genetik işaretleyicidir. Tüm organizmalar, spesifik kısıtlama enzimleri ile sınırlandırıldığında benzersiz DNA profilleri üretir. RFLP, bireylerin benzersiz DNA profillerinin üretilmesinde ve aralarındaki genetik çeşitliliğin saptanmasında önemli bir araç olarak hizmet eder. DNA örnekleri spesifik restriksiyon endonükleazları ile sindirildiğinde, her bireye özgü farklı DNA profilleri verir. Bu nedenle, bu yöntemin prensibi, homolog DNA'yı spesifik restriksiyon enzimleri ile kısıtlayarak organizmalar arasındaki genetik varyasyonun tespiti ve jel elektroforezi ve blotlama yoluyla fragman uzunluk polimorfizminin analizidir. Blot kalıpları her organizmaya özgüdür ve belirli genotipleri karakterize eder.
Aşağıdaki adımlar RFLP ile ilgilidir.
- Numunelerden yeterli miktarda DNA izolasyonu
- Spesifik restriksiyon endonükleazları ile DNA örneklerinin kısa sekans halinde parçalanması
- Agaroz jel elektroforezi ile farklı uzunluklarda elde edilen fragmanların ayrılması.
- Southern blotting ile jel profilinin bir zara transferi
- Etiketli problarla zarın hibridizasyonu ve her profilde fragman uzunluğu polimorfizminin analizi
RFLP'nin kalıtımsal hastalıkların teşhisi, genom haritalama, adli çalışmalarda suçlu tanımlama, babalık testi vb. gibi çeşitli uygulamaları vardır.
Şekil 02: RFLP genotipleme
RAPD ve RFLP arasındaki fark nedir?
RAPD vs RFLP |
|
| RAPD, rastgele primerlere ve PCR'ye dayalı moleküler bir işaretleyicidir. | RFLP, farklı uzunluk kısıtlama fragmanlarının üretimine dayalı moleküler bir işaretleyicidir. |
| Gerekli Örnek | |
| RAPD analizi için küçük DNA örnekleri yeterlidir. | RFLP analizi için büyük miktarda ekstrakte edilmiş DNA örneği gereklidir. |
| Zaman | |
| RAPD hızlı bir işlemdir. | RFLP zaman alan bir süreçtir. |
| İlk Kullanım | |
| Rastgele primerler kullanılır ve aynı primerler farklı türler için kullanılabilir. | Türlere özgü problar, hibridizasyon için RFLP'de kullanılır. |
| Güvenilirlik | |
| Tekniğin güvenilirliği RFLP'ye kıyasla daha azdır. | RFLP güvenilir bir tekniktir. |
| Lekeleme | |
| RAPD, güney lekelemeyi içerir. | Güney lekeleme, RFLP'nin bir adımıdır. |
| Alel Varyasyonunun Tespiti | |
| Allelik varyasyonlar RAPD tarafından tespit edilemez. | Allelik varyasyonlar RFLP ile tespit edilebilir. |
| Sıra Bilgisi Gereksinimi | |
| RAPD ön dizi bilgisi gerektirmez. | Prob tasarımı için önceden dizi bilgisi gereklidir. |
| PCR | |
| PCR, RAPD ile ilişkilidir | PCR, RFLP ile ilgili değildir. |
| Tekrarlanabilirlik | |
| RAPD düşük tekrarlanabilirliğe sahiptir | RFLP, RAPD'ye kıyasla yüksek tekrarlanabilirliğe sahiptir. |
Özet – RAPD ve RFLP
RAPD ve RFLP moleküler biyolojide kullanılan önemli belirteçlerdir. Her iki yöntem de organizmalar arasındaki genetik çeşitliliği tespit etme yeteneğine sahiptir. RAPD, rastgele primerler kullanılarak gerçekleştirilir. RFLP, spesifik kısıtlama enzimleri kullanılarak gerçekleştirilir. Her iki yöntem de bireysel organizmalara özgü DNA profilleri üretir. RAPD, RFLP'den nispeten daha az adım içerir. Ancak RFLP'den daha az güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar üretir. RAPD ve RFLP arasındaki temel fark budur.
